rnapulldown實(shí)驗(yàn)流程
使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記*rna探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成rna-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過westernblot實(shí)驗(yàn)檢測特定的rna結(jié)合蛋白是否與rna相互作用。蛋白質(zhì)與rna的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mrna組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。若待檢測目的蛋白明確，選擇westernblot鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
rnapull-down是檢測rna結(jié)合蛋白與其靶rna之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。rnapull-down使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記*rna探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成rna-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過westernblot實(shí)驗(yàn)檢測特定的rna結(jié)合蛋白是否與rna相互作用。
1)lncrna篩選：
通過lncrna芯片或rna測序等方法對(duì)多對(duì)疾病模型和對(duì)照樣本組織進(jìn)行l(wèi)ncrna表達(dá)譜分析；
通過生物信息學(xué)的方法篩選出具有表達(dá)差異的lncrna，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測lncrna的靶基因；
通過pcr或northernblot技術(shù)對(duì)候選lncrna驗(yàn)證，確定其表達(dá)差異。
2)lncrna確定：
通過5'race獲取lncrna5'全長，3'race獲取lncrna3'全長，zui終拿到完整的lncrna序列。
3)表達(dá)分析：
細(xì)胞水平表達(dá)：在細(xì)胞水平進(jìn)行檢測表達(dá)差異。組織分布：檢測不同組織、不同階段表達(dá)特性。
表達(dá)水平動(dòng)力學(xué)變化：比較不同處理?xiàng)l件下，如藥物處理、誘導(dǎo)處理下，表達(dá)水平差異。
4)功能研究：
功能獲得性研究：構(gòu)建lncrna過表達(dá)載體:原則上是將全長lncrna定向克隆到表達(dá)載體上實(shí)現(xiàn)lncrna的過表達(dá)。然而有些lncrna很大或全長尚未分離，這時(shí)將視lncrna在基因組上的定位采取不同的研究策略。
功能缺失性研究：可通過sirna、shrna、反義核酸等方法沉默lncrna，干預(yù)lncrna后檢測其對(duì)疾病相關(guān)基因表達(dá)的影響和對(duì)細(xì)胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等的影響；
采用rnapulldown、rna-rip(rnabindingproteinimmunoprecipitation)、chirp-seq(chromatinisolationbyrnapurification)等方法檢測與lncrna結(jié)合的dna、rna、蛋白質(zhì)。
采用lncrna芯片分析技術(shù)結(jié)合mrna對(duì)lncrna功能進(jìn)行預(yù)測，研究lncrnatrans和cis作用機(jī)制。
采用配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，設(shè)計(jì)一種rna配體，與癌癥相關(guān)的lincrna結(jié)合達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。
采用快速預(yù)測rna與蛋白質(zhì)相互作用與結(jié)構(gòu)域（catrapid）在線算法來預(yù)測rna與蛋白質(zhì)的相互作用，該算法根據(jù)rna和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、氫鍵和分子作用力來評(píng)估它們之間的相互作用的傾向。
采用非編碼rna沉默和定位分析（c-klan）技術(shù)對(duì)lncrna進(jìn)行功能缺失
（loss-of-function）研究和細(xì)胞定位，該技術(shù)是在基于核糖核酸內(nèi)切酶制備的小干擾rna（esirna）和熒光原位雜交（fish）2種現(xiàn)有的研究方法的基礎(chǔ)上建立起來的。
5)表達(dá)調(diào)控：將lncrna表達(dá)與其他領(lǐng)域相結(jié)合，解釋lncrna調(diào)控機(jī)理。dna甲基化：可通過檢測相應(yīng)基因甲基化差異與lncrna結(jié)合分析。轉(zhuǎn)錄因子：研究lncrna與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。染色質(zhì)重塑：lncrna表觀調(diào)控。一.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、搖菌
1.取jm109感受態(tài)細(xì)菌80µl，加入1.5mlep管中，用10µl槍頭沾取質(zhì)粒加入上述ep管中，混勻。
2.冰上靜置30min。
3.42℃熱休克90-120s。
4.迅速移至冰上靜置2min。
5.在超凈臺(tái)內(nèi)，于上述ep管中加入50µllb培養(yǎng)基（amp－），37℃，160rpm搖床，增菌0.5-1h。
6.菌液4,000rpm離心10min，棄大部分上清，將沉淀重懸，菌液全部加入lb平板（amp+）上，涂布均勻，37℃倒置培養(yǎng)（過夜12-15h）。
7.將37℃培養(yǎng)（12-16h）平板取出，于無菌操作臺(tái)中挑取單克隆放入內(nèi)含5mllb培養(yǎng)基（amp+）的15ml離心管中，于37℃、250rpm搖床增菌過夜18h,看菌液是否渾濁。菌液渾濁后進(jìn)行質(zhì)粒中提。
二.質(zhì)粒中提（tiangen，dp107-02）
1.柱平衡：向吸附柱cp3中（吸附柱放入收集管中）加入500µl的平衡液bl，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清。
2.取1.5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清。
3.向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl溶液p1使用移液器*細(xì)菌沉淀。
4.向離心管中加入250µl溶液p2，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。
5.向離心管中加入350µl溶液p3，立即溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12,000rpm，離心10min，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。
6.將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱cp3中，12,000rpm，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp3放入收集管中。
7.向吸附柱cp3中加入500µl去蛋白液pd，12,000rpm離心，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp3重新放回收集管中。
8.向吸附柱cp3中加入600µl去蛋白液pw，12,000rpm離心，離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp3重新放回收集管中。重復(fù)一次。
9.將吸附柱cp3重新放回收集管中，12000rpm離心2min。
10.將吸附柱cp3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50µl洗脫緩沖液eb，室溫放置2min，12,000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中，放冰盒，測濃度。
三.質(zhì)粒線性化：
本實(shí)驗(yàn)使用的酶為biolabs的重組酶kpnⅰ。酶切后進(jìn)行跑膠。
四.瓊脂糖凝膠電泳
1.配膠。成分：瓊脂糖粉、tbe、ⅰh2o，少量eb。
2.tbe與h2o混合加入放好瓊脂糖粉的錐形瓶中，搖勻，放入微波爐加熱1-2min。
3.滴加少量eb，于錐形瓶中搖勻。
4.倒入膠板中，插入梳子，待瓊脂糖凝固。
5.小心拔掉梳子，取10µl樣品加入1µl的10×loadingbuffer緩緩加入點(diǎn)樣孔，并在zui右邊的點(diǎn)樣孔加5µldnamaker。
6.接通電源。
7.電泳完畢，關(guān)閉電源。從膠模中取出瓊脂糖凝膠，于紫外燈下切下目的條帶。
五.膠回收（tiangen，dp214-02）
1.向吸附柱cb2中加入500µl平衡液bl，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
2.將單一的目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。
3.向膠塊中加入等倍體積溶液pc，50℃水浴放置10min左右，其間不斷的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。
4.將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱cb2中12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管中。
5.向吸附柱cb2中加入600µl漂洗液pw，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管中。
6.重復(fù)操作步驟⑤。
7.將吸附柱cb2放入收集管中，12,000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，*晾干。
8.將吸附柱cb2放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液eb，室溫放置2min，12,000rpm離心2min，收集dna溶液。
六.轉(zhuǎn)錄以及*標(biāo)記：
1.取無rna酶管，按下表操作：
2.取出孵育好的ep管，加入2µl的dnaseⅰ，37℃孵育15min以除去體系中的dna。
3.取出上述操作的ep管，加入2µl0.2medta（ph=8.0）終止反應(yīng)。
4.取1µgbiotin標(biāo)記的rna，加入適量structurebuffer,使得rna形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后將rna95℃加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min。
5.磁珠準(zhǔn)備：使用ripwashbuffer500µl沖洗磁珠3次。
6.用50µlripwashbuffer重懸磁珠，然后將其加入到*標(biāo)記并變性的rna中，4℃過夜。
7.過夜的混合物3000rpm離心1min，去上清。
8.ripwashbuffer沖洗3次，切記將液體沿壁加入或者滴加，上下緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，切勿用移液器吹打。
9.往磁珠-rna混合物中加入細(xì)胞裂解液，裂解液中加入適量rnase抑制劑，室溫放置1h。
10.將孵育好的磁珠-rna-蛋白混合物低速離心，上清回收，使用ripwashbuffer沖洗3次，1次1ml。
11.于樣品中加5×sds上樣緩沖液，95℃變性10min，跑sds-page凝膠。
12.考染：取出sds-page凝膠于考馬斯亮藍(lán)染色液中，搖床過夜。次日用考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色1~2h，中間更換幾次脫色液至條帶清晰，背景低為止。13.將目的條帶切下送測序(質(zhì)譜檢測)。
問題1：rna降解
可能原因：
1）無核酸酶的環(huán)境被破壞
2）體外轉(zhuǎn)錄的rna探針降解
解決辦法：
1）清洗和使用新開的離心管和試劑等
2）rna探針合成后，電泳檢測其長度和濃度
問題2：rna結(jié)合蛋白的親和力不夠：
可能原因：
1）結(jié)合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化
2）裂解不*
3）磁珠用量不足
4）rna探針用量不足
解決辦法：
優(yōu)化孵育時(shí)間、溫度、鹽濃度等條件增加裂解液和蛋白上樣量的比例增加裂解液增加磁珠用量增加探針用量確定*和鏈霉親和素效率問題3：rna結(jié)合蛋白沒有結(jié)合
可能原因：
1）靶蛋白量不足
2）緩沖體系不對(duì)
3）rna探針和蛋白的親和力本來就低
解決辦法：
增加上樣蛋白量應(yīng)用低鹽體系加入交聯(lián)試劑問題4：結(jié)合的非特異性高
可能原因：
1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化
2）緩沖環(huán)境嚴(yán)謹(jǐn)性低
3）樣品沒有裂解*和裂解體系沒有優(yōu)化
解決方法：
1）優(yōu)化孵育時(shí)間溫度鹽濃度等條件
2）使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系
3）調(diào)低rna探針和樣品的比例
4）提高裂解液的量
問題5：wb信噪比高
可能原因：
1）陽性信號(hào)率低
2）一抗效率低
3）蛋白沒有充分溶解
解決方法：
1）增加二抗的量
2）用敏感度的化學(xué)發(fā)光液
3）用細(xì)胞裂解液預(yù)孵一抗
4）增加樣品的量
5）確定有沒有其他可能的結(jié)合情況
6）增加裂解液用量