高效液相色譜儀色譜填料分析：分離親水氣單胞菌外毒素的功能高分子凝膠色譜填料
曾慶冰 ， 許 家瑞 ， 符若文， 葉巧真
中山大學(xué)生命材料科學(xué)研究所， 廣東 廣州 5 1 0 2 7 5
聚合物基復(fù)合材料與功能材料重點(diǎn)實驗室
摘要 由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油懸 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝膠 z s p， 并用 i r、 溶
劑吸收 實驗等對合成 的 z s p的結(jié)構(gòu)進(jìn) 行了確證 。以商 品葡聚糖凝 膠色譜 s e p h a d d e x — g1 0 0為對
照 ， 研究 了 zs p 一 1 0對 中華鱉致 病的親水氣單 胞菌外毒素蛋 白的分 離性能 ， 結(jié)果 表明經(jīng) s e p h a d e x —
g1 0 0和 z s p一 1 0提純的外毒素蛋白均保留了生物活 （ 毒） 性 ， 純度高 。 從 s ds — p age分析結(jié)果 ， 可以
認(rèn)為經(jīng)提純的毒素蛋 白是分 子量 為 3 2 kda的純品。與 s e p h a d e x — g1 0 0凝膠相 比， 聚丙 烯酰胺凝膠
色譜填料 z s p一 1 0對 蛋 白質(zhì) 的回收率更 高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好 的應(yīng) 用前景 的蛋 白
質(zhì)分離色譜填料。
關(guān)鍵詞 ： 親水氣 單胞菌外毒素 聚丙烯酰胺凝膠
1 前言
在生物技術(shù)制取蛋 白質(zhì) 的多級純化過程
中， 液相色譜被為一個必須步驟 ， 這表明操
作條件溫和、 又具有分子水平分離能力的液相
色譜為開創(chuàng)現(xiàn)代生物大分子化學(xué)樹立了一個里
程碑。在液相色譜 中， 無論是哪一種層析方法 ，
分離介質(zhì) 的性能都是分離效果 的首要決定 因
素。目前所使用的多糖類蛋白色譜分離存在的
普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等問題 。開
發(fā)高效的蛋 白分離介質(zhì)受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛
關(guān)注。蛋白分離層析介質(zhì) 的發(fā)展趨勢可以認(rèn)為
是對以天然大分子為母體 的層析介質(zhì)不斷地進(jìn)
行合成工藝改進(jìn) ， 提高性能 ， 使老產(chǎn)品更新?lián)Q
代； 同時大力開發(fā)以合成高聚物為骨架 的具有
優(yōu)異性能的新一代產(chǎn)品。
親水氣單胞菌在 自然界尤其在水體環(huán)境中
分布甚廣， 屬弧菌科， 能引起人和動物的多種疾
病n ， 特別是水生動物暴發(fā)性傳染病 ， 此病在我
國東南各地廣泛流行 ， 尤 以水溫較高的夏秋季
為劇， 導(dǎo)致水生養(yǎng)殖魚類大量死亡， 給漁業(yè)生產(chǎn)
造成重大經(jīng)濟(jì)損失 矗 。
親水氣單胞菌在習(xí)慣上被認(rèn)為是條件致病
菌 ， 隨著細(xì)菌本身的研究的深入 ， 這一認(rèn)識正在
被修正 。已有報道該菌的 o抗原、 菌毛及一些
表 面的非特異性粘附因子與該菌的致病性有
關(guān)“ 。 然而， 更多的報道指出致病侏能產(chǎn)生細(xì)胞
外毒素 ， 而毒素與致病關(guān)系密切 ~ 7 。 但是關(guān)于
毒素的種類和性質(zhì)諸說不一 ， 未有定論。 我們用
自制的凝膠色譜介質(zhì)對 中華鱉致病的親水氣單
胞菌素進(jìn)行了分離。
2 實驗部分
2 ． 1 菌種
親水氣單胞菌菌株從廣東省東莞市某養(yǎng)殖
場患病的中華鱉中分離鑒定， 取材選取瀕死新
本研究由國家 自然科學(xué)基金委杰 出青年科學(xué)基金資助（ 項 目編號 ： 5 9 6 2 5 3 0 7 ）
2 ． 2 細(xì)菌培養(yǎng)
親水氣單胞菌菌株接種合成培養(yǎng)基 中， 搖
床培養(yǎng) 3 5 ℃， 1 0 0 r ／ mi n， 2 4 h。 培養(yǎng)物經(jīng) 4_ c， 1 o
0 0 0 r ／ mi n離心 3 0 mi n ， 取上清液。 將此上清液
對小 白鼠（ 體重 1 8 ~2 2 g ） 腹腔進(jìn)行注射（ 劑量
為 0 ． 4 ml ／ 只） ， 確證其生物活性 。
2 ． 3 聚丙烯酰胺凝膠色譜填料 z s p的合成
在 甲 苯 和 溶 劑 中加 入 少 量
twe e n 一 8 0和 1 9 ／ 6 ， 滴加丙烯酰胺和甲
又丙烯酰胺水溶液 ， 5 0 v水浴恒溫 ， 滴加完畢待
分散均勻后加入適量過硫酸銨， 待反應(yīng)完成后 ，
撤去水浴 ， 體系 自然冷卻至室溫， 減壓抽濾 ， 真
空干燥 ， 篩選出 2 0 0 ~3 0 0目產(chǎn)物備用。
2 ． 4 紅外分析： 采用布魯克 equi nox 5 5傅
里葉變換紅外光譜儀 ， 波數(shù)范 圍為 4 0 0 ~4 0 0 0
c m～， 樣品采用 kb r壓片法進(jìn)行測試。
2 ． 5 溶劑吸收實驗
將干燥至恒重 的 0 ． 1 ～0 ． 2 g z s p聚合物
凝膠置于一特制的底部帶有多孔玻璃砂板的試
管中， 在室溫下置于溶劑 （ 水） 中浸泡 2 4 h。試
管用橡膠蓋密封 ， 放到一離心管內(nèi)， 用 2 0 0 0 ~4
0 0 0 r ／ mi n離心 1 5 mi n除去過量的溶劑 ， 將帶
有溶脹劑的樹脂的試管迅速轉(zhuǎn)移到密閉的燒瓶
中稱重。溶劑吸收量用 1 g干樹脂 吸收的溶劑
重 量來表 示 。
2 ． 6 毒素的提純
2 ． 6 ． 1 硫酸銨鹽析
用 na oh調(diào)節(jié)細(xì)菌培養(yǎng)物上清液至 p h 6 ，
再加入硫酸銨至 7 o 的飽和度 ， 4 ℃靜置 4 h，
1 0 0 0 0 r ／ mi n， 4 ℃離心 3 0 mi n， 去上清液， 沉淀
溶于洗脫緩沖液 中， 對相同緩沖液透析過夜 ， 將
透析后的樣品用 p eg2 0 0 0 0進(jìn)行濃縮 ， 即為粗
提毒素。
2 ． 6 ． 2 s e p h a d e x g一 1 o 0凝膠過濾
將粗提 毒素 于 4 ℃裝 s e p h a d e x g1 0 0柱
（ p h a ma c i a產(chǎn)品， 1 ． 6×5 0 c m， 平均液及洗脫液
均為 5 0 mmo l ／ l tr i s — hc1 ， p h 7 ． 8 ） ， 流速為 1 2
ml ／ h， 每管收集 4 ml ， 用紫外檢測儀 2 8 0 n m進(jìn)
行檢測， 合并生物活性部分 ， 凍干濃縮。
2 ． 6 ． 3 z s p 一 1 0凝膠過濾
將 粗 提 毒 素 于 4 n c裝 交 聯(lián) 度 為 1 o 9 ／ 5 的
z s p 一 1 0 柱 （ 自制 ， 1 ． 6 ×5 0 c m， 平衡液及洗脫液
均 為 0 ． 2 mo l ／ i na ac — hac ， p h5 ． o ） ， 流速為
1 2 ml ／· h， 每管收集 4 ml ， 用紫外檢測以 2 8 0
n m進(jìn)行檢測 ， 合并生物活性部分， 凍干濃縮 。
2 ． 7 sds— page
采 用 la e mml i 不 連續(xù) s ds — p age系統(tǒng) ，
按常規(guī)方法在小型蛋白電泳儀上進(jìn)行 1 0 0 v恒
壓電泳約 3 h。 所用分離膠濃度為 1 2 9 ／ 6 ， 濃縮膠
濃度為 4 9 ／ 6 ， 用考馬斯蘭法染色。
2 ． 8 小 白鼠毒性試驗
小 白鼠體重 1 8 ～2 2 g， 每組 2只， 分別腹腔
注射 0 ． 4 ml 毒素樣品。
3 結(jié)果與討論
3 ． 1 i r分析
圖 1 聚丙烯酰胺凝膠填料的 i r譜圖
圖 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 膠 滲 透色 譜填 料 而引起的。 3 1 8 8 c m 處的強(qiáng)峰是 n— h伸縮振動
z s p 一 1 0的紅外譜圖。3 3 9 4 c m 處寬而強(qiáng)的峰是 吸收峰。 2 9 3 2 c m 和 2 7 8 1 c m 處的強(qiáng)峰是 ch
一
oh伸縮振動的譜帶 ， 由樣 品中殘留水分存在 基團(tuán)中不對稱和對 稱 c— h伸縮振動峰。1 6 6 3
—
1 9 —
chi nes e j ． di al ． & arti f． organs vo 1 ． 1 4 no ． 1 ma r c h， 2 0 0 3
c m。 處的強(qiáng)峰是 c=0伸縮振動吸收峰。1 4 0 0
c m～， 1 3 0 0 c m～， l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰
是 c— n伸縮振動和一 nh變形振動引起的。6 2 7
c m 處的峰是 n— h面外變形吸收峰。
3 ． 2 z s p樹脂的吸水率
圖 2是 z s p樹脂吸水率一交聯(lián)度曲線。 很
明顯， 在交聯(lián)度為 5 ～2 0 的范圍內(nèi)樹脂 的
吸水率與交聯(lián)度成正 比。 由此可推測， 在所合成
的聚合物中交聯(lián)點(diǎn)的分布是 比較均勻的。
o0 5 ．o o％ i o． 00 ％ l 5 ． o0 ％ 2 0． o（ 2 5 |t ） 儡
空娃度
圖 2 z s p樹脂吸水率一 交聯(lián)度 曲線
3 ． 3 毒素的純化
粗提毒素經(jīng) s e p h a d e x- -gl o 0凝膠色譜柱
純化后 回收率為 1 8 ． 8 3 ， 經(jīng)交聯(lián)度為 1 0 的
聚 丙 烯 酰 胺 z s p 一 1 0柱 純 化 后 回 收 率 為
6 8 ． 0 5 ， 洗脫液蛋峰分別為圖 3和圖 4 。上樣
后 s e p h a d e x a —g1 0 0濕凝膠 在 4 ℃只能保 存
■ d ■’ h● ¨
圖 3 毒素的 s e p h a d e x — g 1 0 0層析
3 ． 4 sds— page
經(jīng) s e p h a d e x—g 1 0 0和聚丙 烯酰胺 z s p一
1 0柱純化后的毒素進(jìn)行 s ds — p age， 考馬斯蘭
圖 5 s e p h a d e x純化 s ds — p age
行 m： 分子量標(biāo)準(zhǔn) ， 行 a：
粗提毒素 ． 行 b： 提純毒素
1 0天左右即會滋生霉菌， 不能再重復(fù)使用。而
z s p 一 1 0 在 同樣的條件下可保存半年。 提純毒素
經(jīng)濃縮后注射小 白鼠， 2 4 h后小 白鼠死 亡， 可
以認(rèn)為兩種凝膠色譜柱均保留了外毒素蛋白質(zhì)
的生物 活性 。
圖 6 zs p 一 1 0純化 s ds — page
行 m： 分子量標(biāo)準(zhǔn)， 行 a；
粗提毒素 ， 行 b ： 提純毒素
4 結(jié)論 1
由丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在水油懸液中
共 聚得 到交 聯(lián)度 為 1 0 的 聚丙 烯 酰胺 凝膠 ‘
z s p 一 1 0 。z s p 一 1 0對使 中華鱉致病 的親水氣單
胞菌外毒素蛋 白的分離性能 良好 ， 保留了生物 ．
活（ 毒） 性， 純度 高。 從 s d s — p ag e分析結(jié)果 ， 可
以認(rèn)為經(jīng)提純 的毒素蛋白是分子量為 3 2 kda 5
的純品。與 s e p h a d e x — g1 0 0凝膠相比， 聚丙烯
酰胺凝膠色填料 z s p一 1 0對蛋 白質(zhì) 的回收率更 6
高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好的應(yīng)用
前景的蛋白質(zhì)分離色譜填料。 7
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4 3 8
（ 收稿 ： 2 0 0 0 — 1 0 — 1 8 ）
群體反應(yīng)性抗體（ p ra） 高的免疫吸附治療
于 穎 ， 孟 建中
濟(jì)南 *總醫(yī)院血液凈化 中心 ， 山東 濟(jì)南 2 5 0 0 3 1
摘 要 目的 ： 研究高群體反應(yīng)性抗體 （ p ra） 的患者進(jìn)行 腎移植， 術(shù)后常發(fā)生超急性 （ har）
或急性排斥 （ ar） 反應(yīng) ， 導(dǎo)致移植腎功能 喪失 。方 法； 1 8例 pra高的患者行免疫吸附 （ 1 a） 治療
前血液透析 1 ～6年。8例第 2次腎移植 ， 3例第 3次腎移植 。p ra 2例>7 o ， 5例 >5 o ， 5例
>3 o ， 6例>2 o 。 采 用 日本 p l a s a u t o — l q免疫吸附系統(tǒng)機(jī)進(jìn)行 免疫 吸附治療 。 結(jié)果 ； 1 8例 p ra
高 的患者行 l a 治療 3 ～8次后 ， 復(fù)查 pra． 9例為 0 ， 6例<5 ， 3例 <1 o ， 都 達(dá)到了治療效果 。
結(jié)論 ： p ra 的檢測對提 高腎移植 成功率和存活率具有實際意義 ． 移 植后未發(fā)生 har和 ar， 為
患者解決 了因 pra 高而不能 腎移植 的難題 。
關(guān)鍵詞 ： 群體反應(yīng)性抗體 免疫吸附治療 腎移植
腎移植是治療慢性腎功能不全終末期腎衰
的主要方法， 若移植后的腎功能恢復(fù)正常，
其發(fā)揮的作用遠(yuǎn)大于任何類型的透析。腎移植
的優(yōu)勢還在于能使患者骨髓代謝恢復(fù)正常 ， 消
除貧血， 并能正常生活與工作。 而群體反應(yīng)性抗
體（ p ra） 高的患者進(jìn)行 腎移植， 術(shù)后常發(fā)生超
急性 （ har） 或急排 斥 （ ar） 反應(yīng)， 導(dǎo)致移植 腎
功能喪失 ， 甚至危機(jī)患者生命 。為解決這一難
題， 我院 自2 0 0 1年 1月至今， 為 1 8例患者行免
疫吸附（ i a） 治療療效顯著 ， 現(xiàn)總結(jié)如下 。
1 資料與方法
1 ． 1 一般資料
我院 自2 0 0 1年 1月至今為 1 8例 pra高
的患者行免疫吸附（ i a） 治療 ， 男性 1 1例， 女性
7例 ， 年齡 1 8 ～6 5歲。 9例原發(fā)病均為慢性腎小
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