適配子（aptamer）是對(duì)某個(gè)靶點(diǎn)分子有特異結(jié)合的dna或rna寡核苷酸，因其分子識(shí)別能力在診斷和治療應(yīng)用中具有巨大的潛力。然而，高親和力和高特異性的核酸適配子往往不容易獲得。適配子一般是通過selex方法從核酸庫(kù)中進(jìn)行篩選，這個(gè)方法依賴于將靶點(diǎn)分子固定在某個(gè)固相，再去釣取潛在與靶點(diǎn)結(jié)合的適配子，但是固化有可能導(dǎo)致的空間位阻限制了靶點(diǎn)和適配子結(jié)合的自由度。
背景與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
近期的一篇文章中，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院黃震組先將靶點(diǎn)生物素化，然后將生物素靶點(diǎn)（hpv l1蛋白）和適配子在液相中混合形成適配子-靶點(diǎn)復(fù)合物，再用偶聯(lián)鏈霉親和素的固相介質(zhì)（包括磁珠和octet® 傳感器）去抓取這種復(fù)合物，并進(jìn)行洗脫鑒定，這樣便成功克服了先固化靶點(diǎn)所帶來的不利影響，使得適配體的篩選效率顯著提升，該方法被稱之為 free aptamer-ligand interaction (frari)[1]。
圖1. frari示意圖：通過多輪frari循環(huán)，富集和篩選到高親和力的適配子
本篇文章在篩選適配子過程中做了2個(gè)不同維度的比較：
1
selex, octet® (bli法，生物層干涉), 和mb (磁珠法)三種方法的比較；
2
隨機(jī)生物素化靶點(diǎn)和定點(diǎn)生物素化靶點(diǎn)的比較：前者通過靶點(diǎn)蛋白的氨基隨機(jī)共價(jià)偶聯(lián)生物素，后者通過avi tag在n端進(jìn)行定點(diǎn)生物素化，原則上后者可以更好地保持靶點(diǎn)的天然結(jié)構(gòu)。
octet® 的實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
將生物素化靶點(diǎn)和dna文庫(kù)室溫下孵育1小時(shí)。然后，使用octet® 的sa傳感器與混合物孵育50分鐘來捕獲形成的復(fù)合物。用pbs洗滌兩次（一次600秒，一次120秒）后，將捕獲的復(fù)合物傳感器用蛋白酶k（1.8μl，20mg/ml）52°c中消化2小時(shí)。接下來，擴(kuò)增、制備次輪文庫(kù)，進(jìn)行多輪篩選后測(cè)序鑒定。
a
c
b
圖2. selex, mb, octet® 三種方法比較（定點(diǎn)生物素化法）：selex 九輪富集的特異適配子豐度（a）遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于frari方法，包括bli（b）和mb（c）
對(duì)比發(fā)現(xiàn)，octet® 法和mb法在進(jìn)行6輪篩選后便能富集獲得特異性適配子，而在經(jīng)過9輪篩選后，octet® 法和mb法均實(shí)現(xiàn)了高豐度的特異性適配子富集。并且基于frari的octet® 法篩選出的幾個(gè)高親和力適配子與基于mb法篩選的結(jié)果是一致的。更關(guān)鍵的是，octet® 法豐度的區(qū)分度更好，比如最高豐度的一個(gè)適配子（藍(lán)色）占絕大多數(shù)，隨后的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該適配子具有更強(qiáng)的親和力，說明octet® 可以更好地區(qū)分特異性適配子的親和力。
方法驗(yàn)證
octet® 篩選出的豐度較好的適配子（s4）親和力是否更強(qiáng)呢？作者將生物素化的適配子固化在鏈霉親和素（sa）傳感器上，與靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行結(jié)合解離，以計(jì)算結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
圖3. octet® 法篩選出的適配子與靶點(diǎn)親和力，可見s4的親和力最高，kd值達(dá)到幾十nm
隨后作者使用octet® 法篩選的適配子成功建立了基于夾心法的hpv臨床診斷方法，實(shí)現(xiàn)了臨床樣品中hpv的檢測(cè)，進(jìn)一步證明這些適配子的強(qiáng)親和力和特異性。
octet® 傳感器不僅適合frari法，而且相對(duì)mb法，octet® 可以排除許多低親和力適配子，這可能是因?yàn)閎li傳感器具有較少的表面積和非特異性結(jié)合。因此，octet® 為核酸適配體的選擇提供了高效率的篩選方法。
最近廣西大學(xué)發(fā)表的一篇文章中，開發(fā)了一種便攜式、獨(dú)立的核酸適配子傳感器用于檢測(cè)蝗蟲信息素4-乙烯基苯甲醚（4va），以監(jiān)測(cè)蝗蟲種群動(dòng)態(tài)，實(shí)現(xiàn)蝗災(zāi)預(yù)警。使用octet® 的垂釣方法獲得了針對(duì)4va的kd值為269.25±90.65nm的高親和力適配子，并用此來建立傳感器檢測(cè)方法。
圖4. 使用octet® 傳感器固化4-乙烯基苯甲醚（4va），結(jié)合適配子庫(kù)，然后用不同強(qiáng)度方法洗脫與4va結(jié)合的適配子
表1. octet® 篩選的適配子用octet®進(jìn)行親和力測(cè)定
octet® 不僅可以用于垂釣，也可以用于親和力的驗(yàn)證哦！
octet® 用于親和力驗(yàn)證的優(yōu)點(diǎn)在于：
非標(biāo)記direct binding是趨勢(shì)，不需要標(biāo)記和信號(hào)放大，可以更好地保持反應(yīng)物的活性
快速測(cè)定親和力，提供結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)更加定量化地表征分子互作
無洗滌步驟，可測(cè)弱親和力（解離快）
寫入了美國(guó)藥典，文章多，認(rèn)可度廣
萬金油技術(shù)，可以用與檢測(cè)dna，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子
操作簡(jiǎn)便，耗材及維護(hù)成本低
大家大膽地使用垂釣神器 octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)去發(fā)現(xiàn)未知世界吧！
《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集第三版》
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-參考文獻(xiàn)-
【1】highly-efficient selection of aptamers for detecting various hpv subtypes in clinical samples.talanta 2023.
【2】development of functional nucleic acid sensor for detection of locust pheromone 4-vinylanisole.chemical engineering journal 466 (2023) 143065