中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
gb/t 41133-2022
番茄制品中番茄紅素、葉黃素、胡蘿卜素含量的測(cè)定
超高效液相色譜法
determination of lycopene，lutein and carotene in tomato products-
ultra performance liquid chromatography（uplc）method
前言
本文件按照gb/t1.1--2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。
本文件由全國(guó)質(zhì)量監(jiān)管重點(diǎn)產(chǎn)品檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（sac/tc 374）提出并歸口。
本文件起草單位：上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院、中檢華納（北京）質(zhì)量技術(shù)中心有限公司、華納通標(biāo)（北京）認(rèn)證有限公司。
本文件主要起草人：翁史昱、林琳、林毅侃、黃雨晴、張?chǎng)?、鄭翌、葛宇、陳羽菲、孟杰、鄭存哲?br>1范圍
本文件規(guī)定了超高效液相色譜法測(cè)定番茄制品中番茄紅素、葉黃素、胡蘿卜素含量的原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度、檢出限和定量限。
本文件適用于番茄粉、番茄醬、番茄飲料、番茄干制品中番茄紅素、葉黃素、a-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的測(cè)定。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
3術(shù)語和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。
4原理
試樣加入水和乙醇后，用乙醚-正己烷-環(huán)己烷混合溶液提取其中的番茄紅素、葉黃素、胡蘿卜素，超高效液相色譜法分離，紫外檢測(cè)器或者二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
5試劑和材料
除非另有規(guī)定，僅使用色譜純?cè)噭?br>5.1水：gb/t 6682，一級(jí)。
5.2環(huán)己烷（c6h12）。
5.3乙醚[（c2h5）2o]。
5.4正己烷（c6h14）。
5.5無水乙醇（c2h5oh）：分析純。
5.6二丁基羥基甲苯（c15h24o，bht）：分析純。
5.7甲醇（ch3oh）。
5.8二氯甲烷（ch2cl2）。
5.9萃取溶劑：用分析天平（6.3）稱取1.0 g bht（5.6）.以400 ml正己烷（5.4）溶解，加入200 ml環(huán)己烷（5.2）和400 ml乙醚（5.3），混勻。
5.10 0.1 % bht和二氯甲烷溶液：用分析天平（6.3）稱取1.0 g bht（5.6），加入1 000 ml二氯甲烷（5.8）混勻。
5.11 0.1 % bht、乙醇和二氯甲烷溶液：用分析天平（6.3）稱取1.0 g bht（5.6），以900 ml乙醇（5.5）溶解，加100 ml二氯甲烷（5.8）混勻。
5.12番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（c40h56，cas號(hào)：502- 65 -8）：純度大于或等于98%。
5.13葉黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（c40h56o2，cas號(hào)：127-40-2）：純度大于或等于98%。
5.14 a-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（c40h56，cas號(hào)：7488-99-5）：純度大于或等于98%。
5.15β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（c40h56，cas號(hào)：7235-40-7）：純度大于或等于98%。
5.16番茄紅素儲(chǔ)備液（50μg/ml）：用分析天平（6.3）準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.01 mg）番茄紅素（5.12），以0.1% bht和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 ml。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液應(yīng)充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期3個(gè)月。番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前應(yīng)按附錄a的規(guī)定校正。
5.17葉黃素儲(chǔ)備液（50μg/ml）：用分析天平（6.3）準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.01 mg）葉黃素（5.13），以0.1% bht和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 ml。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液應(yīng)充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期6個(gè)月。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前應(yīng)按附錄a的規(guī)定校正。
5.18 a-胡蘿卜素儲(chǔ)備液（50μg/ml）：用分析天平（6.3）準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.01 mg）a-胡蘿卜素（5.14），以0.1% bht和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 ml。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液應(yīng)充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期6個(gè)月。a-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前應(yīng)按附錄a的規(guī)定校正。
5.19β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液（50μg/ml）：用分析天平（6.3）準(zhǔn)確稱取5 mg（精確至0.01 mg）β-胡蘿卜素（5.15），以0.1% bht和二氯甲烷溶液（5.10）溶解并定容至100 ml。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液應(yīng)充氮避光置于-20℃或以下的冰箱中保存，有效期6個(gè)月。β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液使用前應(yīng)按附錄a的規(guī)定校正。
5.20混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別從番茄紅素儲(chǔ)備液（5.16）、葉黃素儲(chǔ)備液（5.17）、a-胡蘿卜素儲(chǔ)備液（5.18）和β-胡蘿卜素儲(chǔ)備液（5.19）中各準(zhǔn)確移取0.050 ml、0.100 ml、0.200 ml、0.400 ml、1.00 ml溶液于5個(gè)25 ml棕色容量瓶中，用0.1% bht、乙醇和二氯甲烷溶液（5.11）定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.100μg/ ml、0.200μg/ ml、0.400μg/ ml、0.800μg/ml、2.00μg/ml的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用前配制。
5.21中性氧化鋁固相萃取小柱：500 mg/3 ml，使用前用5 ml萃取溶劑（5.9）淋洗，保持柱體濕潤(rùn)。
5.22 0.22μm濾膜：有機(jī)系。
6儀器設(shè)備
6.1超高效液相色譜儀：配有二元及以上梯度泵，帶二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器。
6.2紫外分光光度計(jì)。
6.3分析天平：感量為0.01 mg和0.01 g。
6.4組織搗碎機(jī)。
6.5渦旋振蕩器。
6.6減壓濃縮裝置。
6.7固相萃取裝置。
6.8離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于5 000 r/min。
7試驗(yàn)步驟
7.1通則
除非另行說明，所有試驗(yàn)操作應(yīng)在500nm以下紫外光的黃色光源或紅色光源環(huán)境中進(jìn)行；提取過程應(yīng)在通風(fēng)柜中操作。
7.2樣品前處理
7.2.1試樣制備
取一定數(shù)量的有代表性的樣品，塊狀或顆粒狀樣品用組織搗碎機(jī)（6.4）粉碎，粉末狀、糊狀或液體樣品充分混勻后，儲(chǔ)存于樣品瓶中。制備好的試樣應(yīng)充氮密封后置于-20℃或以下的冰箱中保存。
7.2.2試樣提取
用分析天平（6.3）稱取5 g（精確到0.01 g）試樣（7.2.1）于50 ml聚丙烯離心管中，加入10 ml水（5.1），混勻，加入10 ml無水乙醇（5.5），15 ml萃取溶劑（5.9）于避光條件下用渦旋振蕩器（6.5）提取3 min后，用離心機(jī)（6.8）5 000 r/min離心3min，吸取上清液于另一50 ml，聚丙烯離心管中，在原離心管中加入15 ml萃取溶劑（5.9）再次萃取，重復(fù)提取2次，合并提取液，用減壓濃縮裝置（6.6）在室溫下濃縮至近干，在渦旋振蕩器（6.5）上用5ml萃取溶劑（5.9）溶解殘?jiān)?，待凈化?br>7.2.3試樣凈化
于固相萃取裝置（6.7）中將提取液（7.2.2）以約1 ml /min的流速過已活化的中性氧化鋁固相萃取小柱（5.21），用5 ml萃取溶劑（5.9）洗脫，合并流出液與洗脫液，用減壓濃縮裝置（6.6）在室溫下濃縮至近干，在渦旋振蕩器（6.5）上用2 ml 0.1% bht、乙醇和二氯甲烷溶液（5.11）溶解殘?jiān)?，過0.22μm濾膜（5.22），待用。
7.3超高效液相色譜條件
超高效液相色譜儀（6.1）的色譜條件如下：
a）色譜柱：多環(huán)芳烴分析用c18色譜柱，1.8μm，100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑）；
b）流動(dòng)相a：甲醇（5.7）+二氯甲烷（5.8）（97：3）；流動(dòng)相b：水（5.1），洗脫梯度應(yīng)符合表1的規(guī)定；
c）柱溫：30℃；
d）流速：0.4 ml/min；
e）進(jìn)樣量：2μl；
f）檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm。
注：由于測(cè)試設(shè)備的多樣性，色譜條件可依超高效液相色譜儀的型號(hào)作相應(yīng)調(diào)整。
7.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
按照7.3測(cè)試條件，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.20）注入超高效液相色譜儀（6.1）中進(jìn)行測(cè)試，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.20）的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.5試樣溶液的測(cè)定
按照7.3測(cè)試條件，將待測(cè)樣品溶液（7.2.3）注入超高效液相色譜儀（6.1）中進(jìn)行測(cè)試。待測(cè)樣品溶液中目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)值應(yīng)在儀器線性相應(yīng)范圍內(nèi)，否則應(yīng)適當(dāng)稀釋?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液（5.20）與待測(cè)樣液等體積進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，對(duì)試樣溶液的色譜峰根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。番茄紅素、葉黃素、a-胡蘿卜素和β胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見附錄b。
8結(jié)果計(jì)算
試樣中組分（番茄紅素、葉黃素、a-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素）的含量xi的計(jì)算按式（1）進(jìn)行：
式中：
xi——試樣中各組分的含量，單位為微克每百克（μg/100 g）；
ρi——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中各組分的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升（μg/ml）；
v——樣品定容體積，單位為毫升（ml）；
f——稀釋倍數(shù)；
m——試樣的取樣量，單位為克（g）；
100——換算系數(shù)。
計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。
9精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
10檢出限和定量限
本文件的檢出限：當(dāng)取樣量為5g、定容體積為2 ml時(shí)，葉黃素的檢出限為1μg/100 g，番茄紅素、a-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的檢出限均為0.6μg/100 g。
本文件的定量限：當(dāng)取樣量為5 g、定容體積為2 ml時(shí)，葉黃素的定量限為3μg/100 g，番茄紅素、a-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素的定量限均為2.0μg/100 g。