2023年2月8日，俄亥俄州立大學(xué)董一州團隊在advanced science發(fā)表了一篇lnp成功遞送sarna至精母細胞治療小鼠不育的文章“cholesterol-amino-phosphate (cap) derived lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying rna and restoration of spermatogenesis in infertile mice”。
基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型。目前，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫(yī)療需求。
mrna療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略。然而，將mrna有效遞送至精母細胞仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn)。因此，研究團隊希望開發(fā)一種新的lnp可以將sarna有效遞送至精母細胞，用于治療男性不育癥。
一、cap lnp的合成、配方和表征
為了增強mrna遞送進入精子細胞，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注。例如，膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分，維持細胞膜的完整性和通透性。先前有研究報道在精子生成過程中膽固醇水平會升高，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系。此外，磷酸基團是磷脂的極性部分，同時也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分，參與細胞運輸途徑。最后，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘?，與帶負電的mrna相互作用。除了生物活性之外，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu)，可以用包封參數(shù)（p值）來描述，會極大地影響 lnps的傳遞效率。通常，p 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（hii 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸。
為了實現(xiàn) lnps 將編碼功能蛋白的 mrna 遞送進精母細胞中，恢復(fù)精子生成的目標，他們整合了3個生物活性分子單元，設(shè)計一系列膽固醇-氨基-磷酸酯(cap)脂質(zhì)，配制成cap lnps。cap lnp 由cap、dope、dmg-peg和編碼dmc1的mrna配制而成。在顯微注射到曲細精管后，cap lnp將dmc1 mrna遞送到精母細胞，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生。
圖1 使用cap lnp遞送編碼dmc1的 mrna 的示意圖
首先，研究團隊構(gòu)建了一條 cap 衍生物的合成路線（圖 2a），并進一步表征了它們的理化性質(zhì)，最終選擇了cap2-4 lnps進行后續(xù)研究。研究者應(yīng)用 cap2-4 lnp 在dmc1-/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(gfp) mrna，24小時后分析 gfp 的表達。如圖 2e所示，cap2-4 lnps 在曲細精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光，而 mc3 lnps 和 alc-0315 lnps 組中幾乎檢測不到 gfp 信號。這些結(jié)果證明 cap2-4 lnps 是精母細胞中 mrna 遞送的優(yōu)良載體，遞送效率明顯高于 mc3 和 alc-0315 lnps。
圖2 cap 脂質(zhì)的合成方法、3d結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較
二、cap lnp可將sarna遞送至dmc1-/-小鼠模型中的精母細胞
接下來，作者比較了傳統(tǒng) mrna和sarna 之間 dmc1 蛋白的表達時程。他們將帶有 flag 標簽的 dmc1 mrna 或 sarna 封裝到cap2-4 lnp 中，并將兩種制劑注射到 dmc1-/-小鼠的曲細精管中。給藥后24和72小時，通過免疫熒光染色評估曲細精管中 dmc1 的表達。如圖3a所示，在cap2-4 lnp-mrna和cap2-4 lnp-sarna 處理的小鼠中24小時均觀察到明顯的 dmc1 表達，但在未處理的小鼠中則沒有。cap2-4 lnp-mrna給藥72小時后，曲細精管中幾乎沒有熒光信號（圖3b）。相反，cap2-4 lnp-sarna處理組仍然顯示出強烈的熒光信號（圖3b）。這些結(jié)果表明，通過 cap2-4 lnp 遞送 sarna 可以維持 dmc1 蛋白表達至少三天。
圖3 在 dmc1-/-小鼠中遞送編碼 dmc1蛋白的傳統(tǒng)mrna或sarna
三、使用cap lnp遞送sarna恢復(fù)dmc1蛋白功能
隨后，作者通過分析聯(lián)會復(fù)合體(sc)來檢查 dmc1 蛋白的功能。sc 是在減數(shù)分裂 i 期間形成的特定結(jié)構(gòu)，負責(zé)同源染色體的聯(lián)會。由于 dmc1 缺陷可破壞 sc 形成并阻止減數(shù)分裂 i 后期的精子發(fā)生，因此 sc 被認為是 dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標。dmc1-/-小鼠用 cap2-4 lnp-sarna 處理，處理后第4天，收集睪丸。通過 sycp1 和 sycp3（參與 sc 形成的兩個主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細胞中的 sc。如圖4a所示, sycp3和sycp1染色清楚地顯示了 wt 小鼠的五個亞階段的特征模式，包括細線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期。在cap2-4 lnp-sarna 處理組中，我們觀察到處于粗線期的sc，這表明同源染色體聯(lián)會的恢復(fù)。此外，對sc在雙線期和終變期的觀察進一步證實了sc可以解體并轉(zhuǎn)運到中期（圖4b）。相反，來自 dmc1-/-小鼠的 sc 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期、雙線期和終變期的 sc（圖4c）。如圖4d所示，在 cap2-4 lnp-sarna 處理后，粗線期、雙線期和終變期精母細胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明使用 cap lnp 遞送 sarna 可恢復(fù)精母細胞中 dmc1 蛋白的功能。
圖4 使用cap lnp遞送sarna可恢復(fù)dmc1-/-小鼠中的dmc1功能
四、cap lnp-sarna 挽救 dmc1-/-小鼠的精子發(fā)生
最后，作者研究了通過 cap2-4 lnp-sarna 恢復(fù) dmc1 蛋白是否可以挽救dmc1-/-小鼠的不育癥。dmc1-/-小鼠用 cap2-4 lnp-sarna 處理。處理后第10天，收集睪丸和附睪。睪丸和附睪切片用花生凝集素(pna)染色，它可以特異性結(jié)合精子細胞頂體（圖5a）。pna 染色的精子細胞位于 wt 小鼠的曲細精管和附睪管中。然而，dmc1-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細胞被 pna-凝集素染色，表明精子細胞生產(chǎn)喪失。相比之下，我們在 cap2-4 lnp-sarna 治療組的曲細精管和附睪管中觀察到了 pna染色的細胞，這是挽救 dmc1-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù)。統(tǒng)計分析顯示，治療組每根小管的pna陽性細胞數(shù)明顯高于未治療組，達到wt組的二分之一左右（圖5b）。因此，這些結(jié)果證明，使用 cap lnp 遞送 sarna可以有效挽救 dmc1-/-小鼠中的精子細胞產(chǎn)生。
此外，對睪丸樣本進行組織學(xué)分析以評估生精發(fā)育。如圖5c所示，wt 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài)，而 dmc1-/-小鼠在精母細胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細胞。與 wt 小鼠相比，dmc1-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d，e）。相比之下，cap2-4 lnp-sarna 重建了 dmc1-/-小鼠的睪丸形態(tài)，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d，e)。精子懸液細胞學(xué)涂片顯示，cap2-4 lnp-sarna處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子，而未處理組未觀察到精子樣細胞（圖5f）。
圖5 使用cap lnp 遞送sarna可挽救 dmc1-/-小鼠的不育表型
總的來說，這項研究利用 cap lnps 可以向精母細胞傳遞 mrna，證明基于mrna療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。absin擁有成熟的mrna制備及l(fā)np包裹技術(shù)。
線性mrna定制流程：
線性mrna定制化合成/定制化服務(wù)
服務(wù)參數(shù)：
1、合成量大于等于200ug/條
2、加帽方式：化學(xué)共轉(zhuǎn)錄法
推薦帽結(jié)構(gòu)：cyncap ag
3、修飾堿基：
n1-methyl-pseudouridine-5'-triphosphate
4、標準定制utr：cyn-cbt
5、序列設(shè)計：1條（定制化合成）；不少于3條（定制化服務(wù)）
6、標準質(zhì)控：rna完整性檢測，rna純度膠圖
7、可選實驗：lnp包裹（請詢價）
8、合成周期：2-4周（定制化合成，不包括細胞驗證）
4-8周（定制化服務(wù)）
環(huán)狀rna定制流程：
環(huán)狀rna定制化合成/定制化服務(wù)
服務(wù)參數(shù)：
1、合成量大于等于200ug/條
2、標準ires：cyn-ires-g
3、合成序列條數(shù)大于等于1條（定制化合成）；不低于3條（定制化服務(wù)）
4、標準交付：1.0 ug/ul
5、標準質(zhì)控：濃度；純度
6、合成周期：4-8周（定制化合成）；6-8周（定制化服務(wù)）
標準臨床概念驗證方案流程：
標準臨床概念驗證方案是我司新推出的專項服務(wù)，可以同時匹配mrna線性/環(huán)狀技術(shù)，協(xié)助快速推進靶點的概念驗證，推進不同構(gòu)型的mrna技術(shù)在動物實驗上獲得藥效學(xué)結(jié)果，以期能夠快速進入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的級別。
對于mrna定制業(yè)務(wù)及技術(shù)感興趣的客戶歡迎聯(lián)系我們進行詳細咨詢、交流。
參考文獻
[1] du s, li w, zhang y, et al. cholesterol-amino-phosphate (cap) derived lipid nanoparticles for delivery of self-amplifying rna and restoration of spermatogenesis in infertile mice. adv sci (weinh). 2023 feb 7:e2300188.
absin特色產(chǎn)品線：
wb相關(guān)：ecl發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠；ihc相關(guān)：二抗試劑盒、組化筆；ip/coip試劑盒；激動劑/抑制劑；血清、bsa、蛋白酶k、ctb、ttx、cee；凋亡試劑盒；呼吸爆發(fā)試劑盒；elisa試劑盒；重組蛋白；抗體: 二抗、標簽抗體、對照抗體；定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標記/檢測)...