elisa實驗常見問題分析
異常
結(jié)果描述
原因分析
對策
白板
顯色步驟結(jié)束后，酶標板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。
試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用
檢查試劑的組分及批號，確認未過期以及所有組分均屬對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。
錯加、漏加試劑底物、顯色劑a或b
嚴格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。
洗板及加樣過程中，酶標受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力
確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈。
終止液誤作洗滌液稀釋或當?shù)孜锞彌_液配制
每次配制時都應(yīng)看清標簽標明物質(zhì)
蒸餾水有問題
確認配制洗液的純化水達到要求且未污染，與好蒸餾水比較。
顯色弱、靈敏度低
實驗結(jié)束后，包括陽性對照、質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。
試劑盒超過期，超過有效期的產(chǎn)品可能會產(chǎn)生很弱的信號；試劑盒沒有按規(guī)定進行保存，受高溫影響；
實驗前檢查試劑的組分及批號，確認試劑未過期。不要將試劑盒長時間置于常溫下，按使用規(guī)定儲藏。
試劑、樣品用前未平衡至室溫
從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡20分鐘左右。
加入試劑的體積和時間有誤，移液器計量不準，吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔；
確定所使用的試劑體積正確，加入時間適當。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應(yīng)*。
洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力
確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染。
孵育時間及孵育溫度未達到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時注意溫度并及時調(diào)整。
孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫。
洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求；洗滌沖擊力太大。浸泡時間太長；
嚴格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時間和洗滌次數(shù)。
顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入；
顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑a，后加顯色劑b，不可將a、b液混合后加入
底物作用時間不夠；
準確定時。
蒸餾水水質(zhì)有問題；
測定蒸餾水配制試劑對酶免疫法的影響。
實驗結(jié)束后，陰陽性對照正常，質(zhì)控正常，但臨床標本感覺顯色較弱
待測標本中可能不含強陽性標本，故結(jié)果可能是正常的
如有懷疑，可復(fù)檢
標本加入疊氮鈉作為防腐劑
酶免實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑
陰陽性對照正常，但質(zhì)控、參考品或個別弱陽性標本未能檢出。
未達要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本，但質(zhì)控或弱陽性標本受溫度變化影響較大而被未檢出
質(zhì)控品或標本避免反復(fù)凍融。標本在一周內(nèi)使用的，可存于2-8℃，如需*保存，應(yīng)置于-20℃以下保存。質(zhì)控品應(yīng)小量分裝，并置于-20℃以下保存。
質(zhì)控品或標本高溫放置過久，或被反復(fù)凍融致待測物滴度下降，而未能檢出
重新設(shè)定酶標儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。
儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配
重新設(shè)定酶標儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配
靈敏度過高、板底高、高背景
終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對照、質(zhì)控正常，標本陰性標本od值過高。
整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯加其他試劑造成，如同時操作兩對半試劑時，測hbsab板用于測hbsag等；
實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用
酶標對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象；
避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈
顯色劑在光照條件下放置過久，實驗前已變藍
顯色劑a、b未使用前避光保存
孵育溫度過高或孵育時間過長；
孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。
未按要求洗板。特別是洗滌時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象
嚴格按說明書要求洗板
花板，一般是由于臨床標本的收集、處理和保存方法不當造成
放置時間（自然放置1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時間（15min）應(yīng)引起注意。
出現(xiàn)隨機性的花板、跳孔現(xiàn)象
樣品離心不*，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細胞成分；
充分離心，3000rpm6分鐘以上。
加樣時交叉污染；
加標本時盡量避免交叉污染。如盛標本的試管周圍常有血痂，易脫落，應(yīng)遠離酶標板。
手工洗板造成的交叉污染
手工洗板時前3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時間，可減少交叉污染
洗板機加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔
疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液，吸液時殘留量要小。
拍板時交叉污染
洗板完畢拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。
假陽性
假陽性現(xiàn)象是一個綜合現(xiàn)象，可參考上文“靈敏度過高、板底高、高背景”中的分析。這里只列舉常見的原因及對策。
計算cutoff值時使用的公式不正確，導(dǎo)致計算得出的cutoff值過低，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性
cutoff值計算公式應(yīng)嚴格參照所屬產(chǎn)品的說明書，應(yīng)注意各個酶免產(chǎn)品的cutoff值計算公式不盡相同
洗板時未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導(dǎo)致花板、跳孔，假陽性增多
嚴格按說明書要求洗板。調(diào)整洗板機時，應(yīng)注意有時儀器標示的液量與實際液量并不相符，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整至每孔注滿。
血清標本處理不當，如未除去細胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現(xiàn)孔底由變藍的跳孔現(xiàn)象，此標本重復(fù)實驗結(jié)果往往是陰性；
放置時間（自然放置1~2h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時間（15min）應(yīng)引起注意
廠家試劑質(zhì)量的變化造成
國家標準要求提高靈敏度時，廠家試劑靈敏度也相應(yīng)提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的
水質(zhì)問題
防止蒸餾水污染
加酶量過多（如50ul誤認為100ul）或丙肝酶稀釋時加量過多
加酶前檢查移液器調(diào)節(jié)量是否準確，稀釋酶時思想要集中
培養(yǎng)箱溫度超過37℃</