非變性質(zhì)譜即天然質(zhì)譜法（native mass spectrometry），是一種用于分析蛋白結(jié) 構(gòu)的質(zhì)譜方法。使用這種方法，不改變蛋白 結(jié)構(gòu)，因此可獲得分析物在天然狀態(tài)下 的結(jié)構(gòu)信息[1] ，這是native ms的在蛋白藥物分 析中的個(gè)重要特性：非變性分析特性。 之所以可以保持蛋白的天然結(jié)構(gòu)，一方面是 因?yàn)樵趎ative ms分析中，避免了乙腈等有機(jī) 溶劑的使用，而是采用乙酸銨中性緩沖溶液； 另一方面，在離子化時(shí)，為了避免了高溫及 高電壓條件，而采用了如納升靜態(tài)噴霧等柔 和的離子化方式[2] 。
相對(duì)于常見(jiàn)的變性質(zhì)譜法，在native ms 的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，蛋白的離子信號(hào)移動(dòng)到 了更高的質(zhì)荷比區(qū)域。這是由于在常見(jiàn)的全 蛋白分子量測(cè)定中（變性質(zhì)譜法），蛋白在 含有乙腈的緩沖液及高溫高電壓的離子化條 件下，其結(jié)構(gòu)被破壞，而伸展開(kāi)來(lái)，暴 露出了更多的可結(jié)合h+的部分，因此攜帶了更 多的電荷。對(duì)于單抗來(lái)說(shuō)，采用變性質(zhì)譜法，其質(zhì)荷比主要分布于2000m/z至4000m/z，而 native ms 條件下 ， 則分布于 5000m/z 至 7000m/z區(qū)域（圖1）。從圖一可以看出，在 native ms圖譜中，不但信號(hào)的分布區(qū)域位于 高質(zhì)荷比區(qū)，更重要的是，由于所帶電荷數(shù) 減少，信號(hào)分布變得疏離。在復(fù)雜樣本分析 時(shí)，疏離的信號(hào)分布會(huì)降低信號(hào)相互覆蓋的 可能性。這是native ms在蛋白藥物分析中的 第二個(gè)重要特性：簡(jiǎn)化圖譜特性。
在單抗藥物相關(guān)分析中，native ms的非 變性分析特性，被用于cystine linked adc（利 用還原二硫鍵形成的抗體-藥物偶聯(lián)物）以及 抗體-抗原結(jié)合等分析；而native ms的簡(jiǎn)化圖 譜特性則被可用于糖基化定量、雙功能抗體、 混合抗體等分析項(xiàng)目中。
由于native ms中樣品的質(zhì)荷比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 常見(jiàn)的質(zhì)譜信號(hào)，因此要對(duì)質(zhì)譜硬件進(jìn)行特 殊設(shè)計(jì)。問(wèn)世的exative plus emrtm質(zhì)譜， 是以超高分辨質(zhì)量分析器orbitrap(靜電場(chǎng)軌道阱)為基礎(chǔ)的，專為native ms分析需求所設(shè)計(jì) 的一款儀器 ， 其質(zhì)荷比范圍可覆蓋至 20000m/z。exative plus emr以其超高分辨率、 信號(hào)基線分辨能力以及*的穩(wěn)定性，不但 被廣泛應(yīng)用在蛋白藥物分析，甚至在分子量 高達(dá)80萬(wàn)da的蛋白復(fù)合體分析中都已被采用[3] （圖2）。
除高質(zhì)荷比范圍采集能力外，去除粘附在 蛋白上的溶液分子及金屬離子也是提高native ms圖譜質(zhì)量的必要條件。粘附分子或離子的 存在會(huì)造成蛋白質(zhì)量變大的假象 [4] （圖3）， 從而影響分析準(zhǔn)確度。exative plus emr在離子 源以及hcd碰撞池，為去除粘附分子及離子做 了*的專門化設(shè)計(jì)[3] 。不同于其他的高分辨 質(zhì)譜，exactive plus emr允許用戶設(shè)置一定的 hcd碎裂能量以去除粘附分子及離子；同時(shí)， *的emr mode具有automatically hcd gascontrol 功能，可對(duì)hcd碰撞池中的n2氣壓進(jìn) 行調(diào)節(jié)。在exactive plus emr上通過(guò)協(xié)同優(yōu)化 源內(nèi)裂解能量 、 hcd 碎裂能量和 hcd gas control三個(gè)參數(shù)，可盡可能多地除去粘附分子 及離子。
隨著單抗藥物市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)及應(yīng)對(duì)抗體抗藥性 的需求，單抗-藥物偶聯(lián)物（antibody drug conjugate，adc）類藥物已經(jīng)成為新型抗體藥 物開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要方向。在各種adc藥物中， 通過(guò)還原單抗二硫鍵，將小分子藥物連接到 半*巰上而形成的cystine linked adc藥物， 由于其較好的結(jié)構(gòu)均一性及更穩(wěn)定的化學(xué)連 接形式，已經(jīng)成為adc藥物開(kāi)發(fā)的重要方向。 但是，由于負(fù)責(zé)連接輕、重鏈的二硫鍵被打 開(kāi)，單抗內(nèi)各鏈間依靠非共價(jià)結(jié)合，因此， 此類adc藥物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差。如果采用 常規(guī)的質(zhì)譜方法分析其dar值（drug antibody ratio），各鏈會(huì)發(fā)生分離，導(dǎo)致分析失敗。 而native ms的非變性分析特性，正適用于此。 圖4為cystine linked adc藥物adcetris進(jìn)行dar 分析的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)（adcetris是fda于2011 年批準(zhǔn)的用于治療霍奇金淋巴瘤以及復(fù)發(fā)性 間變性大細(xì)胞淋巴瘤adc藥物）[4] 。圖中分別 展示了去糖基化與保留糖基化非變性質(zhì)譜數(shù) 據(jù)，可以看到，即使是在樣品復(fù)雜程度巨大的含糖鏈adc藥物的圖譜，含相同小分子藥結(jié) 合數(shù)量的單抗信號(hào)也都被清晰分辨，這就為 dar值的準(zhǔn)確計(jì)算打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
native ms在單抗寡糖的含量測(cè)定分析中 具有*的角度與優(yōu)點(diǎn)（圖5）。在常見(jiàn)的分 析方法中，首先是將糖鏈通過(guò)糖苷酶將寡糖 從蛋白中釋放出來(lái)。被釋放的寡糖將通過(guò)多 步處理，使其連接熒光基團(tuán)。熒光基團(tuán)的加 入是因?yàn)楣烟潜旧頍o(wú)光譜吸收，且離子化效 率非常低，不利于質(zhì)譜分析。標(biāo)記熒光基團(tuán) 后，可使用熒光檢測(cè)器分析，并提高其質(zhì)譜 分析的離子化效率。但是熒光標(biāo)記必須經(jīng)過(guò) 多步復(fù)雜的樣品處理操作，整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間也 需要約2天時(shí)間。因此此種方法具有工作效率低，實(shí)驗(yàn)成本高，操作難度大等缺點(diǎn)。如果 操作經(jīng)驗(yàn)不足，易造成重現(xiàn)性差等問(wèn)題。特 別是對(duì)于含有唾液酸的寡糖，在樣品處理時(shí) 容易丟失，造成實(shí)驗(yàn)分析失敗。此外，在連 接了熒光基團(tuán)的寡糖中，熒光基團(tuán)只占了非 常小的一部分，對(duì)其寡糖離子化效率的提升 有限。這也是寡糖在進(jìn)行液質(zhì)分析時(shí)，采用 液相-熒光檢測(cè)-質(zhì)譜檢測(cè)的原因（熒光信號(hào)主 要負(fù)責(zé)定量，質(zhì)譜信號(hào)主要負(fù)責(zé)定性）。既 然熒光標(biāo)記法具有如此多的不足之處，為何 其在單抗的寡糖分析中仍被廣泛應(yīng)用？歸根 結(jié)底，無(wú)非是因?yàn)橄肟朔烟菣z測(cè)信號(hào)的問(wèn) 題。而單抗上的寡糖其實(shí)天然地?cái)y帶了一個(gè) 可提升信號(hào)的標(biāo)記基團(tuán)——抗體肽鏈部分?？?體分子量近15萬(wàn)da，而糖鏈分子量?jī)H為3-4千
da左右。因此在質(zhì)譜分析的離子化過(guò)程中， 單抗的肽鏈將起到?jīng)Q定性作用。rosati等的研 究，有力的證明了這一點(diǎn)：唾液酸含量是寡 糖離子化大的影響因素，唾液酸越多，寡 糖離子化越差，因此會(huì)造成不同組成糖鏈的 離子化效率不同，從而造成巨大的寡糖定量 分析誤差。rosati等發(fā)現(xiàn)，對(duì)于單抗，采用 native ms分析，在去除唾液酸前后，其定量 結(jié)果相同[4] 。這就證明，在native ms條件下， 唾液酸對(duì)單抗離子化效率沒(méi)有影響， 可以得 到更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果。除避免了由于離子 化效率的影響， native ms不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn) 操作，從而巨大地提高了實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和準(zhǔn) 確度。此外，整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間也大幅縮短，大 大提高了工作效率。在應(yīng)用native ms對(duì)單抗 寡糖準(zhǔn)確定量的背后，包含了native ms的簡(jiǎn)化圖譜特點(diǎn)：native ms疏離的信號(hào)分布會(huì)降 低不同糖型信號(hào)間相互覆蓋的可能性，高質(zhì) 量的原始質(zhì)譜數(shù)，是寡糖準(zhǔn)確定性與定量的 保證。類似的應(yīng)用還有難度更大的混合抗體 分析等[5] 。在natalie等人的工作中，采用以 orbitrap為基礎(chǔ)的native ms分析15個(gè)單抗混合 物，并對(duì)其進(jìn)行定量分析，大定量分析誤 差（標(biāo)準(zhǔn)差）僅為1.14%[5]
借用生物質(zhì)譜人heck在2012年nature methods上的一段話作為結(jié)尾“我們相信，以 orbitrap質(zhì)譜分析器為基礎(chǔ)的非變性質(zhì)譜法， 將會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)研究，特別是生物藥物表 征分析等多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的影響”[3] 。
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