非變性質(zhì)譜在ADC及單抗糖基化分析中的應(yīng)用

發(fā)布時(shí)間:2024-04-02
非變性質(zhì)譜即天然質(zhì)譜法(native mass spectrometry),是一種用于分析蛋白結(jié) 構(gòu)的質(zhì)譜方法。使用這種方法,不改變蛋白 結(jié)構(gòu),因此可獲得分析物在天然狀態(tài)下 的結(jié)構(gòu)信息[1] ,這是native ms的在蛋白藥物分 析中的個(gè)重要特性:非變性分析特性。 之所以可以保持蛋白的天然結(jié)構(gòu),一方面是 因?yàn)樵趎ative ms分析中,避免了乙腈等有機(jī) 溶劑的使用,而是采用乙酸銨中性緩沖溶液; 另一方面,在離子化時(shí),為了避免了高溫及 高電壓條件,而采用了如納升靜態(tài)噴霧等柔 和的離子化方式[2] 。
相對(duì)于常見(jiàn)的變性質(zhì)譜法,在native ms 的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)中,蛋白的離子信號(hào)移動(dòng)到 了更高的質(zhì)荷比區(qū)域。這是由于在常見(jiàn)的全 蛋白分子量測(cè)定中(變性質(zhì)譜法),蛋白在 含有乙腈的緩沖液及高溫高電壓的離子化條 件下,其結(jié)構(gòu)被破壞,而伸展開(kāi)來(lái),暴 露出了更多的可結(jié)合h+的部分,因此攜帶了更 多的電荷。對(duì)于單抗來(lái)說(shuō),采用變性質(zhì)譜法,其質(zhì)荷比主要分布于2000m/z至4000m/z,而 native ms 條件下 , 則分布于 5000m/z 至 7000m/z區(qū)域(圖1)。從圖一可以看出,在 native ms圖譜中,不但信號(hào)的分布區(qū)域位于 高質(zhì)荷比區(qū),更重要的是,由于所帶電荷數(shù) 減少,信號(hào)分布變得疏離。在復(fù)雜樣本分析 時(shí),疏離的信號(hào)分布會(huì)降低信號(hào)相互覆蓋的 可能性。這是native ms在蛋白藥物分析中的 第二個(gè)重要特性:簡(jiǎn)化圖譜特性。
在單抗藥物相關(guān)分析中,native ms的非 變性分析特性,被用于cystine linked adc(利 用還原二硫鍵形成的抗體-藥物偶聯(lián)物)以及 抗體-抗原結(jié)合等分析;而native ms的簡(jiǎn)化圖 譜特性則被可用于糖基化定量、雙功能抗體、 混合抗體等分析項(xiàng)目中。
由于native ms中樣品的質(zhì)荷比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 常見(jiàn)的質(zhì)譜信號(hào),因此要對(duì)質(zhì)譜硬件進(jìn)行特 殊設(shè)計(jì)。問(wèn)世的exative plus emrtm質(zhì)譜, 是以超高分辨質(zhì)量分析器orbitrap(靜電場(chǎng)軌道阱)為基礎(chǔ)的,專為native ms分析需求所設(shè)計(jì) 的一款儀器 , 其質(zhì)荷比范圍可覆蓋至 20000m/z。exative plus emr以其超高分辨率、 信號(hào)基線分辨能力以及*的穩(wěn)定性,不但 被廣泛應(yīng)用在蛋白藥物分析,甚至在分子量 高達(dá)80萬(wàn)da的蛋白復(fù)合體分析中都已被采用[3] (圖2)。
除高質(zhì)荷比范圍采集能力外,去除粘附在 蛋白上的溶液分子及金屬離子也是提高native ms圖譜質(zhì)量的必要條件。粘附分子或離子的 存在會(huì)造成蛋白質(zhì)量變大的假象 [4] (圖3), 從而影響分析準(zhǔn)確度。exative plus emr在離子 源以及hcd碰撞池,為去除粘附分子及離子做 了*的專門化設(shè)計(jì)[3] 。不同于其他的高分辨 質(zhì)譜,exactive plus emr允許用戶設(shè)置一定的 hcd碎裂能量以去除粘附分子及離子;同時(shí), *的emr mode具有automatically hcd gascontrol 功能,可對(duì)hcd碰撞池中的n2氣壓進(jìn) 行調(diào)節(jié)。在exactive plus emr上通過(guò)協(xié)同優(yōu)化 源內(nèi)裂解能量 、 hcd 碎裂能量和 hcd gas control三個(gè)參數(shù),可盡可能多地除去粘附分子 及離子。
隨著單抗藥物市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)及應(yīng)對(duì)抗體抗藥性 的需求,單抗-藥物偶聯(lián)物(antibody drug conjugate,adc)類藥物已經(jīng)成為新型抗體藥 物開(kāi)發(fā)的一個(gè)重要方向。在各種adc藥物中, 通過(guò)還原單抗二硫鍵,將小分子藥物連接到 半*巰上而形成的cystine linked adc藥物, 由于其較好的結(jié)構(gòu)均一性及更穩(wěn)定的化學(xué)連 接形式,已經(jīng)成為adc藥物開(kāi)發(fā)的重要方向。 但是,由于負(fù)責(zé)連接輕、重鏈的二硫鍵被打 開(kāi),單抗內(nèi)各鏈間依靠非共價(jià)結(jié)合,因此, 此類adc藥物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差。如果采用 常規(guī)的質(zhì)譜方法分析其dar值(drug antibody ratio),各鏈會(huì)發(fā)生分離,導(dǎo)致分析失敗。 而native ms的非變性分析特性,正適用于此。 圖4為cystine linked adc藥物adcetris進(jìn)行dar 分析的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)(adcetris是fda于2011 年批準(zhǔn)的用于治療霍奇金淋巴瘤以及復(fù)發(fā)性 間變性大細(xì)胞淋巴瘤adc藥物)[4] 。圖中分別 展示了去糖基化與保留糖基化非變性質(zhì)譜數(shù) 據(jù),可以看到,即使是在樣品復(fù)雜程度巨大的含糖鏈adc藥物的圖譜,含相同小分子藥結(jié) 合數(shù)量的單抗信號(hào)也都被清晰分辨,這就為 dar值的準(zhǔn)確計(jì)算打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
native ms在單抗寡糖的含量測(cè)定分析中 具有*的角度與優(yōu)點(diǎn)(圖5)。在常見(jiàn)的分 析方法中,首先是將糖鏈通過(guò)糖苷酶將寡糖 從蛋白中釋放出來(lái)。被釋放的寡糖將通過(guò)多 步處理,使其連接熒光基團(tuán)。熒光基團(tuán)的加 入是因?yàn)楣烟潜旧頍o(wú)光譜吸收,且離子化效 率非常低,不利于質(zhì)譜分析。標(biāo)記熒光基團(tuán) 后,可使用熒光檢測(cè)器分析,并提高其質(zhì)譜 分析的離子化效率。但是熒光標(biāo)記必須經(jīng)過(guò) 多步復(fù)雜的樣品處理操作,整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間也 需要約2天時(shí)間。因此此種方法具有工作效率低,實(shí)驗(yàn)成本高,操作難度大等缺點(diǎn)。如果 操作經(jīng)驗(yàn)不足,易造成重現(xiàn)性差等問(wèn)題。特 別是對(duì)于含有唾液酸的寡糖,在樣品處理時(shí) 容易丟失,造成實(shí)驗(yàn)分析失敗。此外,在連 接了熒光基團(tuán)的寡糖中,熒光基團(tuán)只占了非 常小的一部分,對(duì)其寡糖離子化效率的提升 有限。這也是寡糖在進(jìn)行液質(zhì)分析時(shí),采用 液相-熒光檢測(cè)-質(zhì)譜檢測(cè)的原因(熒光信號(hào)主 要負(fù)責(zé)定量,質(zhì)譜信號(hào)主要負(fù)責(zé)定性)。既 然熒光標(biāo)記法具有如此多的不足之處,為何 其在單抗的寡糖分析中仍被廣泛應(yīng)用?歸根 結(jié)底,無(wú)非是因?yàn)橄肟朔烟菣z測(cè)信號(hào)的問(wèn) 題。而單抗上的寡糖其實(shí)天然地?cái)y帶了一個(gè) 可提升信號(hào)的標(biāo)記基團(tuán)——抗體肽鏈部分???體分子量近15萬(wàn)da,而糖鏈分子量?jī)H為3-4千
da左右。因此在質(zhì)譜分析的離子化過(guò)程中, 單抗的肽鏈將起到?jīng)Q定性作用。rosati等的研 究,有力的證明了這一點(diǎn):唾液酸含量是寡 糖離子化大的影響因素,唾液酸越多,寡 糖離子化越差,因此會(huì)造成不同組成糖鏈的 離子化效率不同,從而造成巨大的寡糖定量 分析誤差。rosati等發(fā)現(xiàn),對(duì)于單抗,采用 native ms分析,在去除唾液酸前后,其定量 結(jié)果相同[4] 。這就證明,在native ms條件下, 唾液酸對(duì)單抗離子化效率沒(méi)有影響, 可以得 到更為準(zhǔn)確的定量結(jié)果。除避免了由于離子 化效率的影響, native ms不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn) 操作,從而巨大地提高了實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和準(zhǔn) 確度。此外,整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間也大幅縮短,大 大提高了工作效率。在應(yīng)用native ms對(duì)單抗 寡糖準(zhǔn)確定量的背后,包含了native ms的簡(jiǎn)化圖譜特點(diǎn):native ms疏離的信號(hào)分布會(huì)降 低不同糖型信號(hào)間相互覆蓋的可能性,高質(zhì) 量的原始質(zhì)譜數(shù),是寡糖準(zhǔn)確定性與定量的 保證。類似的應(yīng)用還有難度更大的混合抗體 分析等[5] 。在natalie等人的工作中,采用以 orbitrap為基礎(chǔ)的native ms分析15個(gè)單抗混合 物,并對(duì)其進(jìn)行定量分析,大定量分析誤 差(標(biāo)準(zhǔn)差)僅為1.14%[5]
借用生物質(zhì)譜人heck在2012年nature methods上的一段話作為結(jié)尾“我們相信,以 orbitrap質(zhì)譜分析器為基礎(chǔ)的非變性質(zhì)譜法, 將會(huì)對(duì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)研究,特別是生物藥物表 征分析等多個(gè)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的影響”[3] 。
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