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電轉百科指南②：不同細胞的電轉技巧，收藏了慢慢看！
電轉百科指南③：手把手教程來了，20種常用細胞的實驗方案
電轉百科指南④：每日問候你的細胞轉染結果好嗎，支原體污染要避免
本周第五期電轉百科我們將更進一步，為大家?guī)韈rispr基因編輯的內容，本章內容將分為knock-out與knock-in上下篇，請繼續(xù)關注下一期的后續(xù)！
01/上篇
knock-out
lonza nucleofector™核轉染系統可以廣泛應用于多種不同的場景，在不同的應用場景下通常會使用dna或rna或蛋白進行外源基因的遞送，以實現特殊的應用需求。
以crispr系統為例，全球有大量的客戶使用lonza nucleofector™核轉染系統開展基于crispr系統的基因編輯相關工作并發(fā)表文章且逐年遞增。
▲google scholar search for ‘nucleofector crispr’, july 2023
·對于crispr的轉染，即可以通過表達cas9的質粒系統如px458載體來實現“剪刀” cas9的遞送，也可以通過cas9 mrna的方式在細胞質中直接翻譯，與sgrna形成復合物后再進入細胞核進行基因組編輯。當然我們也可以在轉染前提前將cas9蛋白與sgrna進行孵育形成rnp復合物，再通過電轉染遞送到細胞內，直接進入細胞核進行基因組編輯。
·對于crispr應用，主要用于knock-out或knock-in
knock out：盡管knock-out已經比較容易實現高效的敲除效率，但對于陌生的細胞或者全新的位點依然需要進行適當的調整。包括但不限于以下方面：
不同的nucleofection條件測試
lonza為多種常用的細胞提供預優(yōu)化的電轉程序，電轉程序與細胞相關，通常來說，即使電轉不同的核酸底物(dna，rna，蛋白等)無需對電轉程序進行調整，但在越來越多的原代細胞轉染中，使用rna或rnp進行細胞基因編輯時，可以通過對程序進行適當的微調，以獲得更高編輯效率的同時，更好的維持細胞的活率及功能。對于常見的t cell，hspc，nk，dc等免疫細胞可以對nucleofection脈沖條件進行適當調整。
▲akiko seki et al., 2018
不同的crrna/sgrna測試
對于同一基因不同的sgrna表現可能不同，目前已有大量設計sgrna序列的工具，部分工具也可以為其打分，但通常還是建議盡可能測試多個sgrna以確保實驗結果。甚至結合多條sgrna對同一基因進行編輯。
▲akiko seki et al., 2018
不同cas9蛋白的測試
對于不同供應商的cas9蛋白也存在切割活性的差異，對于wt cas9和一些經過優(yōu)化的cas9蛋白也會導致編輯效率的差異。
▲akiko seki et al., 2018
▲liyang zhang et al., 2021
cas9用量測試
除對不同cas9蛋白來源的測試外，cas9的用量也是需要在試驗優(yōu)化中考量的因素。
▲liyang zhang et al., 2021
cas9:sgrna比例測試
對于cas9蛋白和sgrna形成的蛋白復合物，以何種比例添加進行孵育轉染必定也是重要的因素。在大多數的出版物中，cas9:grna的比值在1:1.2 - 1:5之間。
▲akiko seki et al., 2018
electroporation enhancer
有時可以考慮使用electroporation enhancer以實現更高的編輯效率。
▲matteo martufi et al., 2019
市面上大多數提供cas蛋白或sgrna的供應商通常也會提供一份詳細的protocol，可以優(yōu)先參考這些protocol或相關的paper。除上面提到的方向外，供體差異，轉染的時間點，對于免疫細胞(如t細胞)，何種激活劑激活也可能會對最終的結果造成影響。