一、模板1. 模板降解1）盡量選擇新鮮提取的模板進(jìn)行 pcr擴(kuò)增，通過凝膠電泳檢測模板的完整性，若降解嚴(yán)重需要重新制備模板；2）模板避免反復(fù)凍融。2. 模板中含有抑制 dna聚合酶活性的抑制劑1）采用離心柱法提取核酸，純化模板，消除抑制劑的干擾；2）適當(dāng)減少模板量，采用梯度稀釋摸索最佳模板量；3）選用抗逆性強(qiáng)的 dna聚合酶。3.模板量太低1）適當(dāng)增加模板量；2）模板為 cdna時，選用目的基因表達(dá)量高的組織提取高質(zhì)量 rna并選用基因克隆專用的反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到的 cdna作為模板；3）選用靈敏度高的 dna聚合酶。4. 高 gc, 復(fù)雜模板1）使用 pcr添加劑（比如 dmso，甜菜堿）或 gc enhancer，促進(jìn)高 gc，復(fù)雜序列模板雙鏈解離從而有利于引物退火和序列延伸；2）增加變性時間或溫度，使 dna雙鏈解離；3）選用適用于高 gc，復(fù)雜模板擴(kuò)增的 dna聚合酶。5. 長片段1）確保模板的完整性；2）選擇適用于長片段擴(kuò)增的 taqdna 聚合酶或者高保真 dna聚合酶；3）在試劑盒說明書建議的延伸速度基礎(chǔ)上適當(dāng)延長延伸時間；4）采用抑制熱交錯 pcr（suppression thermo-interlaced pcr, sti pcr）策略。二、引物1.引物降解1）重新合成高質(zhì)量引物，少量分裝保存，防止多次凍融，避免長期置于冰箱冷藏部分。2.引物設(shè)計不合理1）建議使用引物設(shè)計軟件（比如 primerpremier 6, oligo 7等）設(shè)計并選取評分較高的引物；2）確保引物和模板結(jié)合的特異性。三、dna聚合酶及其他反應(yīng)組分1. dna聚合酶選擇不合適1）根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的 dna聚合酶，比如分子克隆實驗中涉及到序列的高保真擴(kuò)增，需要選擇一款針對不同類型序列具有普適性的高保真酶。2.dna聚合酶活力下降1）檢查試劑是否過期，按照說明書要求合理保存試劑。3.反應(yīng)緩沖液體系與目的基因不匹配1）不同目的 pcr反應(yīng)要求反應(yīng)緩沖液中的鎂離子、鉀離子、銨離子、化學(xué)添加劑等成分濃度是不一樣的，建議使用試劑盒中優(yōu)化好的緩沖液體系。四、反應(yīng)條件1. 退火溫度不合適，影響引物與模板特異結(jié)合1）使用引物設(shè)計軟件建議的退火溫度，退火溫度一般比引物的 tm 值低 5 ℃；2）不同的試劑鹽離子濃度不同，最佳的退火溫度可能存在差異，建議以軟件建議退火溫度為中心設(shè)置溫度梯度，來獲得最佳退火溫度；3）設(shè)置降落 pcr（step-down）反應(yīng)程序。2. 其他反應(yīng)條件不合適1）不同的 dna聚合酶試劑最佳反應(yīng)條件是有差別的，選用試劑說明書建議的變性溫度和時間，退火時間，延伸溫度和速度，循環(huán)數(shù)。