中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)
gb/t 36858-2018
飼料中黃曲霉毒素b1的測定
高效液相色譜法
determination of aflatoxin b1 in feeds-
high performance liquid chromatography
警示——黃曲霉毒素b1是高致癌物質(zhì)，應(yīng)小心處理，分析操作過程應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)或指定區(qū)域內(nèi)進行。分析過程中，操作者應(yīng)采取相應(yīng)的防護措施。分析過程結(jié)束后，接觸過的器皿及黃曲霉毒素b1溶液應(yīng)使用濃度為5%的次氯酸鈉溶液浸泡過夜。
1范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定飼料中黃曲霉毒素b1的高效液相色譜法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料中黃曲霉毒素b1的測定。
本方法的檢出限為0.5μg/kg，定量限為2.0μg/kg。
2規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包據(jù)所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
gb/t 14699.1飼料采祥
gb/t 20295動物飼料試樣的制備
3原理
試樣中的黃曲霉毒素b1經(jīng)黃曲霉毒素b1提取溶液提取后，再經(jīng)三氯甲烷萃取、三氟乙酸衍生，衍生后的黃曲霉毒素b1采用反相高效液相色譜-熒光檢測器進行測定，外標(biāo)法定量。
4試劑或材料
除非另有規(guī)定，在分析中僅使用確認為分析純的試劑。
4.1水：符合gb/t 6682中規(guī)定的一級用水。
4.2甲醇：色譜級。
4.3乙腈：色譜級。
4.4三氯甲烷。
4.5黃曲霉毒素b1提取溶液：量取84 ml乙腈，加入到16 ml水中，混勻。
4.6黃曲霉毒素b1衍生溶液：分別量取20 ml三氟乙酸，加入70 ml水中，混勻后加入10 ml冰乙酸，混勻。臨用現(xiàn)配。
4.7流動相：分別量取20ml甲醇、10ml乙腈和70ml水，混勻。經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后備用。
4.8黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（1000μg/ml）：精確稱取黃曲霉毒素b1對照品（純度≥98%）10.0 mg，用10 ml乙腈完全溶解，配制成黃曲霉毒素b1含量為1 000μg/ ml的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20℃保存，有效期為6個月。或有證標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4.9黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取1.0 ml黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用乙腈定容至100 ml，濃度為10μg/ml。再取此稀釋液1.0 ml，用乙腈定容至100 ml，則濃度稀釋為100 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
4.10黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：將黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用乙睛分別稀釋成1 ng/ml、
2 ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。臨用現(xiàn)配。
4.11有機濾膜：直徑50mm，孔徑0.22μm。
4.12針頭式過濾器：有機型，孔徑0.22μm。
4.13乙腈水溶液（90+10）：量取90 ml乙腈，加入到10 ml水中，混勻。
5儀器設(shè)備
5.1高效液相色譜儀：配備熒光檢測器。
5.2分析天平：感量為0.01 mg。
5.3溶劑過濾器：規(guī)格1 000 ml。
5.4氮吹儀。
5.5恒溫振蕩器。
5.6旋渦混合儀。
5.7超聲波清洗儀。
5.8水浴鍋。
6樣品
按gb/t 14699.1規(guī)定采集有代表性的試樣，按照gb/t 20195規(guī)定將試樣粉碎，過0.42 mm分析篩，混勻后裝入密閉容器中，備用。
7試驗步驟
7.1試樣處理
平行做兩份試驗。稱取5.00 g（精確到0.01 g）試樣置于100 ml帶塞錐形瓶中，加入25.0 ml黃曲霉毒素b1提取溶液（4.5），室溫下200 r/min振蕩提取60 min，用中速濾紙過濾，取10.0 ml濾液于50 ml具塞離心管中，加入10.0 ml三氯甲烷（4.4）萃取，旋渦混合1 min，靜置分層后，取下層萃取液于15 ml具塞離心管中，50℃水浴氮氣吹干。加入200μl乙腈水溶液（4.13）復(fù)溶，然后加入700μl黃曲霉毒素b1衍生溶液（4.6），加塞混勻，40℃下恒溫水浴街生反應(yīng)75 min后，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，待測。
7.2標(biāo)準(zhǔn)系列
分別取0.9 ml黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（4.10）于7個10 ml具塞離心管中，50℃水浴氮氣吹干，用200μl乙腈水溶液（4.13）復(fù)溶，然后加700μl黃曲霉毒素b1衍生溶液（4.6），加塞混勻，40℃下恒溫水浴術(shù)生反應(yīng)75 min，再經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后，待測。
7.3高效液相色譜參考條件
色譜柱：c18色譜柱，長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5μm；或性能相當(dāng)者。
流動相（4.7）。
流速：1 ml/min。
激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長：440 nm。
柱溫：30℃。
進樣體積：20μl。
7.4測定
在上述液相色譜參考條件下，將衍生后的黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液、試樣溶液注入高效液相色譜儀，測定相應(yīng)的響應(yīng)值（峰面積），采用單點或多點校正，外標(biāo)法定量。黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖參見附錄a。
8試驗數(shù)據(jù)處理
試樣中黃曲霉毒素b1的含量以質(zhì)量分數(shù)ω表示，單位為微克每千克（μg/kg），按式（1）計算：
式中：
ρ——試樣衍生液在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的黃曲霉毒素b1含量，單位為納克每毫升（ng/ml）；
v1——提取液的總體積，單位為毫升（ml）；
v2——用于萃取的提取液體積，單位為毫升（ml）；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
0.9——衍生后的試樣溶液體積，單位為毫升（ml）。
以兩個平行樣品測定結(jié)果的算術(shù)平均值報告結(jié)果，結(jié)果保留至小數(shù)點后一位。
9精密度
在重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差值，不大于該平均值的20%。