牛腺病毒3型探針法熒光定量pcr試劑盒實(shí)驗(yàn)說明：
需要自備的器材：
1．方法儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光 pcr 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µl、20
µl、200 µl、1000 µl）。
2．耗材：熒光 pcr 專用反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 ml 經(jīng)焦碳酸二乙酯（depc）水
處理的滅菌離心管、吸頭（10 µl、200 µl、1000 µl）、滅菌雙蒸水。
反應(yīng)五要素：
參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dntp、模板和mg2+
引物：引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，pcr 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板dna互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板dna在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴(kuò)增效果不佳，g+c過多易出現(xiàn)非特異條帶。atgc*隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致pcr失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
注意事項(xiàng)：
1、使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說明書全文。
2 、操作時(shí)應(yīng)盡量少說話，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽性；整個(gè)檢測(cè)過程中，反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、pcr擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染。
3 、實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑盒組分中的試劑使用前應(yīng)充分融化并混勻（混勻時(shí)禁止激烈振蕩，只需要進(jìn)行上下倒置多次進(jìn)行混勻）。
4、 反應(yīng)管中加好所有的試劑后，應(yīng)盡快上pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增，以免形成過多的二聚體。
5、細(xì)胞培養(yǎng)物中含有青霉素和鏈霉素等抗生物素不會(huì)影響本品的檢測(cè)結(jié)果。如果用戶需要進(jìn)一步提高檢測(cè)。