單壁碳納米管（swcnts）因在近紅外（nir）區(qū)域有穩(wěn)定的光致發(fā)光特性而在生物成像領(lǐng)域應(yīng)用頗多。單鏈dna可以通過非共價鍵與swcnts結(jié)合（dna-swcnts），使swcnts有更好的生物相容性。研究表明，swcnts進(jìn)入人體之后，會被巨噬細(xì)胞“內(nèi)化”，并在溶酶體定位。對swcnts的表面進(jìn)行修飾，可以改變swcnts在細(xì)胞內(nèi)的“命運”。但是，人們對dna單鏈的長度如何影響dna-swcnts在復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中的代謝知之甚少。
2019年3月，美國羅德島大學(xué)daniel roxbury教授課題組在《nano letters》發(fā)表題為“biomolecular functionalization of a nanomaterial to control stability and retention within live cells”的文章，介紹了dna-swcnts與細(xì)胞之間相互作用的關(guān)系。
dna單鏈的長度與dna-swcnts熒光強度的關(guān)系
為了研究dna單鏈的長度對dna-swcnts光學(xué)特性的影響，作者先用五種單鏈dna（(gt)n，n=6，9，12，15，30）對swcnts進(jìn)行修飾，后與小鼠巨噬細(xì)胞一起培養(yǎng)30分鐘（(gt)n-swcnts濃度：1mg/l）。當(dāng)用730 nm激光激發(fā)時，大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出明亮的寬頻發(fā)射（900-1600nm），說明dna-cnts被細(xì)胞“內(nèi)化”。作者探究了熒光強度與dna單鏈的長度和時間的關(guān)系，結(jié)果顯示，dna-swcnts熒光強度與dna單鏈長度成正比而與時間成反比。有趣的是，具有較長dna單鏈的dna-swcnts的初始的熒光強度分布較廣，說明長鏈dna使dna-swcnts對近紅外光更敏感。作者對細(xì)胞內(nèi)dna-swcnts的熒光強度進(jìn)行了量化并計算了細(xì)胞內(nèi)的平均熒光強度，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的熒光強度隨著dna鏈長的增加而增加，皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為0.846、0.885和0.850，證實兩者線性相關(guān)且具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1）
圖1：dna-swcnts的熒光強度與dna單鏈長度的關(guān)系；（a）(gt)15-swcnts的熒光圖像、白光圖像和整合的熒光/白光圖像；（b）dna-swcnts的熒光圖像；（c）dna-swcnts熒光強度柱形圖；（d）dna-swcnts的平均熒光強度
dna-swcnts熒光強度與dna單鏈長度和swcnts手性的關(guān)系
為了進(jìn)一步比較swcnts手性與熒光穩(wěn)定性的關(guān)系，作者將發(fā)射中心波長轉(zhuǎn)化為能量，并將dna-cnts的熒光強度與對照組做了對比。研究表明，5種dna-swcnts中，只有(gt)6-swcnts熒光強度隨時間的延長而增加，其他4種dna-swcnts的熒光強度有適度的損失。對于某一種手性的swcnts而言，(gt)n-swcnts熒光強度損失沒有在同一時間段內(nèi)發(fā)生，說明熒光強度的損失是多種因素的結(jié)果。為了在單細(xì)胞水平上研究光譜位移，作者利用高光譜技術(shù)繪制了(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts的高光譜圖像，并將高光譜圖像中每一個包含swcnts像素點擬合到洛倫茲曲線上，用(94)-swcnts的中心輻射能量圖覆蓋白光圖，并為每個圖像構(gòu)建直方圖以描述細(xì)胞內(nèi)swcnts發(fā)射能量的變化。作者發(fā)現(xiàn)，0h的時候，(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts的熒光強度在統(tǒng)計意義上*相同。將直方圖進(jìn)行高斯擬合，可以通過半全寬來評估總體的異質(zhì)性。研究表明，內(nèi)化后(gt)6-swcnts的半高寬是(gt)30-swcnts的兩倍，且(gt)30-swcnts的輻射強度不隨時間變化。6 h后，(gt)6-swcnts的發(fā)射能量降低了8 mev，半高寬降低了50%。作者認(rèn)為，這種近紅外光熒光強度的變化是dna-swcnts復(fù)合物的dna單鏈末端相對豐度變化的結(jié)果，對于dna-swcnts中一定質(zhì)量的dna，(gt)6-swcnts中dna單鏈數(shù)是(gt)30-swcnts的5倍（圖2）。
圖2：熒光強度與dna單鏈的長度和swcnts手性的關(guān)系；（a）細(xì)胞內(nèi)熒光強度的熱圖；（b）(gt)6-swcnts和（c）(gt)30-swcnts的白光圖和高光譜圖像的疊加圖和熒光能量分布直方圖
細(xì)胞內(nèi)dna-swcnts熒光強度的穩(wěn)定性
被細(xì)胞內(nèi)化的dna-swcnts的光譜穩(wěn)定性有較大差異。作者基于swcnts對常規(guī)有機熒光團(tuán)的淬滅效應(yīng)，設(shè)計了一種檢驗dna-cnts完整性的方法。實驗人員首先用cy3對(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts進(jìn)行標(biāo)記，脫氧膽酸鈉（sdc）小分子通過競爭機制取代cy3-dna附著在swcnts的表面，使原來發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)的swcnts重新發(fā)出明亮的熒光。盡管sdc的置換動力學(xué)不相同，但cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts的熒光淬滅動力學(xué)是相似的。當(dāng)用含有cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)巨噬細(xì)胞時，cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts的熒光淬滅現(xiàn)象有很大的不同，cy3-(gt)6-swcnts很快的發(fā)生熒光淬滅并在4 h達(dá)到maximum熒光強度，24h后降至初始熒光強度；相比之下，cy3-(gt)6-swcnts則在任何時間段均未觀察到熒光淬滅現(xiàn)象（圖3）。
圖3：dna-swcnts在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性；（a）實驗設(shè)計示意圖：swctns被dna單鏈緊密包裹時，未發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，dna單鏈解離時發(fā)出強烈熒光；（b）熒光強度隨sdc小分子置換時間的增加而增加；（c）用cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts培養(yǎng)的raw 264.7細(xì)胞的白光圖和熒光圖的疊加；（d）平均熒光強度直方圖
細(xì)胞對dna-swcnts的“內(nèi)化”和“外排”
盡管swcnts的熒光強度受到濃度和局部環(huán)境的影響，但是swcnts的某些特征只和濃度有關(guān)，這就意味著，無論樣本的熒光強度如何，swcnts的手性信息在拉曼圖譜中都可以被表達(dá)出來。作者使用共聚焦拉曼顯微鏡評估了swcnts在細(xì)胞內(nèi)的局部濃度，首先使用1mg/l的cy3-(gt)6-swcnts或cy3-(gt)30-swcnts培養(yǎng)巨噬細(xì)胞30分鐘，對0.5μm的微小區(qū)域進(jìn)行拉曼成像。為了計算出每個細(xì)胞內(nèi)swcnts的質(zhì)量，作者得出了g峰與swcnts濃度的特征曲線。cy3-(gt)6-swcnts培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中swcnts的起始濃度是cy3-(gt)30-swcnts培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的兩倍；24 h后，cy3-(gt)6-swcnts培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)swcnts的濃度下降了75%，而cy3-(gt)30-swcnts培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)swcnts的濃度下降較小。作者將cy3-(gt)6-swcnts培育的巨噬細(xì)胞內(nèi)swcnts的起始濃度高的原因歸結(jié)于單根swcnts上的dna密度較大，這增加了細(xì)胞膜蛋白與dna相互接觸的概率；相反，也正是由于膜蛋白與dna接觸概率的增大，從而使得巨噬細(xì)胞可以更快的以胞吐的形式“釋放”swcnts。
為了更好的理解胞吐機制，作者對細(xì)胞“釋放”(gt)6-swcnts的途徑進(jìn)行了探究。作者設(shè)計了一個實驗，用巴弗洛霉素a1和諾考達(dá)唑（兩種抑制細(xì)胞溶酶體胞吐作用的化學(xué)藥物）對巨噬細(xì)胞進(jìn)行了處理，并比較細(xì)胞內(nèi)dna-swcnts的濃度。結(jié)果顯示，(gt)6-swcnts在細(xì)胞內(nèi)的濃度高于對照組，(gt)30-swcnts的濃度與對照組相比變化不大；相反，用布雷非德菌素a和exo1（兩種抑制高爾基體分泌的化學(xué)藥物）對巨噬細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，(gt)6-swcnts和(gt)30-swcnts的濃度與對照組相比差異性較??；這說明細(xì)胞主要是通過溶酶體的胞吐作用來實現(xiàn)dna-cnts的“釋放”（圖4和圖5）。
圖4：通過共聚焦顯微鏡確定swcnts的濃度；（a）cy3-(gt)6-swcnts和cy3-(gt)30-swcnts培養(yǎng)的raw 264.7細(xì)胞的g峰強度圖和白光圖（b）從細(xì)胞中roi區(qū)域像素點計算得出的swcnts的濃度；（c）被細(xì)胞內(nèi)化的swcnts的比值；（d）細(xì)胞上清液中外源性swcnts的濃度；（e）共聚焦拉曼光譜g峰強度圖與白光圖的疊加；（f）在（e）圖中包含swcnts的所有像素點的平均濃度
溶酶體胞吐的主要功能之一是分泌各種生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶和抗原，以進(jìn)行細(xì)胞之間的信息傳遞，也可使周圍細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。有研究表明，對swcnts的表面進(jìn)行修飾可以有效降低對細(xì)胞的毒性，原始的swcnts與細(xì)胞膜上的受體相互作用之后會被認(rèn)為是一個有害物質(zhì)。因此，作者認(rèn)為溶酶體將dna鏈段從dna-swcnts復(fù)合物上去除后，會使得細(xì)胞將“裸露”的swcnts當(dāng)做異物，而引發(fā)細(xì)胞的胞吐作用將其排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)swcnts的濃度降低；而長鏈的dna對swcnts的包覆比較嚴(yán)密，溶酶體無法將dna-swcnts復(fù)合物上的dna“剔除”，從而無法產(chǎn)生胞吐作用，這會導(dǎo)致(gt)30-swcnts在細(xì)胞內(nèi)的滯留。
圖5：dna長度相關(guān)性的細(xì)胞內(nèi)加工示意圖；（a）巨噬細(xì)胞將(gt)6-swcnts復(fù)合物內(nèi)化并在溶酶體內(nèi)定位，隨后生物分子與dna鏈發(fā)生交換，并迅速誘導(dǎo)溶酶體胞吐；（b）巨噬細(xì)胞將(gt)30-swcnts復(fù)合物內(nèi)化并在溶酶體內(nèi)定位，而dna-swcnts的完整性使swcnts被長時間保留在細(xì)胞內(nèi)
總結(jié)：
作者借助于可見-近紅外高光譜成像和共聚焦拉曼顯微技術(shù)，發(fā)現(xiàn)dna單鏈的長度對dna-swcnts的光學(xué)穩(wěn)定性有影響，通過調(diào)節(jié)dna單鏈的長度可以實現(xiàn)對細(xì)胞“攝入”和“外排”swcnts的調(diào)節(jié)；dna-cnts上較短的dna單鏈在溶酶體內(nèi)被細(xì)胞的生物小分子取代，改變了swcnts的物理特性和在細(xì)胞內(nèi)的“命運”；最后通過藥物實驗證實了細(xì)胞對swcnts的“外排”是通過胞吐作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于人們進(jìn)一步理解swcnts與細(xì)胞之間的相互作用，也為后續(xù)科研人員進(jìn)一步探究細(xì)胞對官能化小分子的“響應(yīng)性”奠定了理論基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
[1] gravely m, safaee m m, roxbury d.biomolecular functionalization of a nanomaterial to control stability andretention within live cells[j]. nano letters, 2019, 19(9) 6203-6212.