那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡單介紹一下關(guān)于掌握蛋白純化中親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。一、目的要求：1.學(xué)習(xí)與掌握親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。
2.了解自動化純化設(shè)備基本組成和原理。
3.了解親和吸附層析瓊脂糖、凝膠過濾葡聚糖的基本性質(zhì)。掌握*標(biāo)簽蛋白的基本性質(zhì)和純化原理和操作；掌握緩沖液置換和脫鹽的原理和操作。
二、實驗概述（如右圖）
實驗步驟：
1.樣品預(yù)處理：即通過超聲這種細(xì)胞破碎的手段，將在大腸桿菌e.coli中表達(dá)的重組的帶6個his標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中，再通過離心，0.2微米濾膜過濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物；
2.*標(biāo)簽蛋白親和層析：histraptmhpcrude,1ml預(yù)裝層析柱，進(jìn)行親和層析，一步就可以達(dá)到90%左右的純度
3.凝膠過濾層析脫鹽去除咪唑：hitraptmdesalting5ml預(yù)裝層析柱進(jìn)行脫鹽，置換緩沖液
4.電泳：對純化過的樣品的檢測。
三、設(shè)備以及試劑準(zhǔn)備（試劑均使用化學(xué)純以上）：
1.儀器：核酸蛋白檢測儀hd系列、自動部分收集器bsz\dbs系列、恒流泵hl系列
2.樣品：egfp原液
3.層析柱：histraphp1ml,1根；hitrapdesalting5ml，1根
4.層析緩沖液
名稱 配方 體積
緩沖液a
親和結(jié)合緩沖液
脫鹽平衡和洗脫緩沖液 25mm 磷酸鹽緩沖液,150mm nacl, 20mm 咪唑,ph7.4 250ml
緩沖液b
親和洗脫緩沖液 25mm 磷酸鹽緩沖液,150mm nacl, 500mm 咪唑,ph7.4 100ml
去離子水 脫氣或負(fù)壓脫氣 500ml
層析柱保存緩沖液 20%乙醇
5.注射器，燒杯，負(fù)壓脫氣瓶等實驗室常用容器
四、實驗內(nèi)容
1.儀器和實驗準(zhǔn)備：
所有緩沖液需要過0.2um膜過濾，負(fù)壓脫氣抽濾瓶脫氣，脫氣裝置如圖所示
樣品預(yù)處理：即通過超聲這種細(xì)胞破碎的手段，將在大腸桿菌e.coli中表達(dá)的重組的帶6個his標(biāo)簽的綠色熒光蛋白釋放到相應(yīng)的緩沖液當(dāng)中，再通過離心，0.45 微米濾膜過濾等去除細(xì)胞碎片和別的污染物；用注射器吸取大于2ml樣品
將注射器內(nèi)的樣品從樣品環(huán)3號口推入，注意不要將氣泡推入樣品環(huán)(如右圖)。
以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于掌握蛋白純化中親和層析和凝膠層析分離的一般原理和操作方法。
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