藥物引發(fā)的肝毒性問題是終止新藥研發(fā)和導(dǎo)致藥物退市最主要的因素之一，同時也是政府監(jiān)管行為見的原因之一。如曲格列酮、非阿尿苷等均因嚴(yán)重肝毒性而被迫撤回。藥物引起肝損傷的發(fā)病機(jī)制主要有藥物直接損害、間接損害( 包括細(xì)胞毒性和膽汁淤積性) 、免疫介導(dǎo)性肝損傷、炎癥反應(yīng)、線粒體失能以及機(jī)體對藥物的特異質(zhì)反應(yīng)。在相關(guān)發(fā)病機(jī)制中，我們對膽汁淤積性肝毒性知之甚少，其臨床前預(yù)測也于評估藥物抑制膽鹽輸出泵的能力，缺乏完善的評價標(biāo)準(zhǔn)。
1 藥品與試劑
asp，apap，nef，tol，fa( 美國 cayman 公司) ;tro( 美國 ｒd 公司) ; iso( 美國 enzo 公司) ; *、*、胎牛血清、willams'medium e 培養(yǎng)基( gibco公司) ; 引物合成( invitrogen 公司) ; tｒnzol 總 ｒna提取試劑、dl2，000 dna marker ［takaｒa( 寶生物)公司］; 抗體( abcam 公司) 。
2 儀器
ｒt-pcｒ 試劑盒、cdna 反轉(zhuǎn)錄試劑盒( qiagen公司) ; 96 孔板( 美國 corning 公司) ; co2 培養(yǎng)箱( 美國 themoforma 公司) ; cck8 試劑盒( 日本同仁化學(xué)研究所) ; *( abcom 公司) ; ql-902 渦旋振蕩儀( 海門市其林貝爾儀器制造有限公司) ; centrifuge 5415d 離 心 機(jī) ( eppendorf 公 司) ;nanodｒop 2000 分光光度計(jì)( therno scientific 公司) ; tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)( 上海天能科技有限公司) ; abi7500 熒光定量 pcｒ 儀( applied biosystems 公 司) ; elx 800 酶標(biāo) 儀 ( 美 國 bio-tek 公司) ; hｒ220 掌上離心機(jī)( servicebio 公司) ; nikon eclipse e100 正置熒光顯微鏡( 日本尼康公司) 。
3 細(xì)胞
hepg2 細(xì)胞( 本實(shí)驗(yàn)室凍存) ; hepaｒg 細(xì)胞( 美國 millipore 公司) 。4 2d 及 3d 細(xì)胞培養(yǎng)hepaｒg 和 hepg2 細(xì)胞接種于含 10% 胎牛血清，100 μml － 1*、100 μg·ml － 1*、4 mmol·l － 1 l-*的 williams'medium e 培養(yǎng)基中，于5% co2 的 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，達(dá)到 70% ～80% 融合時，吸棄培養(yǎng)基，pbs 清洗，加*鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓時終止消化，加少量培養(yǎng)基輕輕吹打制備細(xì)胞懸液，并傳代。3d 培養(yǎng)條件下，將 hepaｒg 分別以每孔 100，200，400，800，1 600 個接種于u 型底低吸附 96 孔板中，于 37 ℃，5% 的 co2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，形成3d 微球結(jié)構(gòu)，可持續(xù)培養(yǎng)28 d，其間通過鏡下觀察球體變化并記錄其直徑大小。
通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件成功構(gòu)建了 3d hepaｒg 肝毒性評價模型，能夠從一定程度上反映出該體外模型的優(yōu)勢，也可以為膽汁淤積性肝損傷的研究提供一定的借鑒，但論據(jù)尚不充分，在接下來的研究中，將利用高內(nèi)涵篩選技術(shù)檢測化合物對細(xì)胞活力、代謝凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各個環(huán)節(jié)的影響，進(jìn)一步探明引起藥物肝損傷的毒性機(jī)制，從而為化合物的安全性預(yù)測提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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