一般來說，腰椎的承受壓力過大被認(rèn)為是退行性椎間盤疾?。╠dd）的主要原因。由不良的生活方式或肥胖引起的過度脊柱負(fù)荷可導(dǎo)致椎間盤（ivd）細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）的代謝紊亂。此外，過度的脊柱負(fù)荷會提高促炎基因的表達(dá)，例如cox2，il-6、il-8。炎癥通常被認(rèn)為是有害因素，并參與ddd的發(fā)作。因此，緩解炎癥反應(yīng)以恢復(fù)ivd結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。作為ivd的重要組成部分，af（纖維環(huán)）可以緩沖脊柱旋轉(zhuǎn)或彎曲引起的力學(xué)負(fù)荷，并有助于預(yù)防np（髓核）突出。細(xì)胞對機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)是纖維環(huán)退變的關(guān)鍵因素。越來越多的證據(jù)表明，機(jī)械信號在調(diào)節(jié)af修復(fù)和再生中起著關(guān)鍵作用。
有研究發(fā)現(xiàn)，整合素信號通路通過核因子κb（nf-κb）的核易位調(diào)控機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明nf-κb家族的激活狀態(tài)。nf-κb活化的增加加速了炎癥和分解代謝基因的轉(zhuǎn)錄，如il-6，il-8，cox2，adamts4和adamts5。此外，nf-κb的激活在關(guān)節(jié)軟骨和終板的張力相關(guān)的退行性變化中起核心作用，并且在退行性椎間盤中可以觀察到nf-κb活性升高。然而，力學(xué)刺激如何控制退行性椎間盤中整合素β1表達(dá)水平和nf-κb的活性仍在很大程度上尚不清楚。
cav1（小窩蛋白-1）是胞膜窖（caveolae）的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，可作為力學(xué)傳感器響應(yīng)來自細(xì)胞微環(huán)境的各種力學(xué)刺激。例如，cav1通過充當(dāng)力學(xué)傳感器來感知剪切應(yīng)力，壓力和拉伸應(yīng)力，從而參與整合素介導(dǎo)的炎癥信號通路。此外，在ivd退變過程中，cav1基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平升高，并且在用 il-1β 處理的ivd細(xì)胞中可以檢測到cav1的高表達(dá)，以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此，闡明cav1、整合素β1和nf-κb在力學(xué)負(fù)荷誘導(dǎo)的退行性進(jìn)展中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，并分析它們之間的關(guān)系，對于ddd治療具有重要意義。
在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科、中國骨科再生醫(yī)學(xué)學(xué)組的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，探索了cav1在af退變過程中整合素β1和nf-κb信號通路的機(jī)械調(diào)控中的作用。研究表明，通過適度的力學(xué)刺激靶向cav1和整合素β1介導(dǎo)的nf-κb信號通路失活可以挽救細(xì)胞炎癥。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，適度的應(yīng)力牽引可修復(fù)退變的椎間盤。這些成果為理解適度運(yùn)動的對退變組織康復(fù)治療提了理論基礎(chǔ)。
為了評估應(yīng)力刺激對afc（纖維環(huán)細(xì)胞）行為的影響，實(shí)驗(yàn)用單軸循環(huán)牽引力（cts，0.2hz）處理afcs，分別使用 0%（ctrl）、2%、5% 和12% 不同幅度的cts 持續(xù)應(yīng)用24 h。5% 或12% cts處理時，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧忓N狀。而且用5% cts處理后s期細(xì)胞的百分比顯著增加，表明5% cts的細(xì)胞增殖水平高于其他組。此外，5% 的cts顯著促進(jìn)了afc的遷移?；谏鲜鼋Y(jié)果，5% 的cts可以被認(rèn)為是適度的力學(xué)刺激，可能有利于細(xì)胞生長。相比之下，12% 的cts對細(xì)胞生長有負(fù)面影響，因此被認(rèn)為是過度的力學(xué)負(fù)荷。
接下來研究了afcs中ecm相關(guān)蛋白（膠原蛋白i，膠原蛋白ii和聚集蛋白聚糖）的表達(dá)。與靜態(tài)條件下和2% 或12% cts下的細(xì)胞相比，在5% cts下afcs中，膠原蛋白i，膠原蛋白ii和聚集蛋白聚糖的表達(dá)水平更高（圖1）。因此，5% 被認(rèn)為是cts控制afcs合成代謝的適度機(jī)械量級。這些結(jié)果還表明，適度的力學(xué)刺激可以促進(jìn)ecm的合成，并有可能促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。
圖1 應(yīng)力刺激對afcs基質(zhì)合成代謝的影響。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測不同牽引力條件下afcs合成代謝基質(zhì)（膠原蛋白i、膠原ii和聚集蛋白聚糖）的表達(dá)水平。
鑒于牽引力刺激對afcs生長和代謝的影響，實(shí)驗(yàn)通過評估促炎基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討了cts 24 h后afcs的炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，在12% cts的afcs中，包括cox2，tnfa，il-1b和il-6在內(nèi)的促炎基因顯著增加。然而，與靜態(tài)條件相比，5% cts對afcs促炎基因的表達(dá)沒有明顯影響（圖2 a）。這可能是由于這些促炎基因在靜態(tài)條件下afcs中的低表達(dá)所致。由于5% cts有利于細(xì)胞生長，推測該水平的力學(xué)刺激可以對afcs產(chǎn)生抗炎作用，因此用il-1β處理afcs以誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，然后使用5% cts 刺激。結(jié)果表明，5% cts能夠顯著逆轉(zhuǎn)il-1β處理的afcs中促炎基因的升高表達(dá)（圖2 b）。這些結(jié)果表明，5% 的cts減弱了il-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但12% 的cts加劇了這一過程。
圖2 應(yīng)力刺激對afcs促炎基因mrna表達(dá)的影響。
（a）不同牽引力加載條件下afcs中促炎基因（cox2，tnfa，il-1b和il-6）相對表達(dá)的qpcr分析。（b）在存在或不存在il-1β的情況下，用5% cts處理的afcs中促炎基因（cox2，tnfa，il-1b和il-6）相對表達(dá)的qpcr分析。
為了研究不同應(yīng)力負(fù)荷處理的afcs中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組變化，采用rna測序來量化afcs中的mrna水平?；虮磉_(dá)熱圖顯示，5% cts組和ctrl組的表達(dá)模式相似，而與 12% cts組的表達(dá)模式差異很大，表明在12% cts處理下，afcs發(fā)生了顯著變化。之后go和通路富集分析，12% cts上調(diào)的前七個生物過程或通路，其中炎癥反應(yīng)、分解代謝過程和凋亡通路被激活，而細(xì)胞增殖呈負(fù)調(diào)控。具體而言，在12% cts處理的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)炎癥基因（ptgs2，il-6，nfkb1等），力學(xué)敏感基因（cav1，itgbl1，itga3等）和分解代謝基因（mmp17，mmp3，timp1等）的顯著上調(diào)，合成代謝基因（col2a1，col11a1，col14a1等）下調(diào)。相反，與對照組相比，5% cts組的小分子生物合成過程、ecm組織和細(xì)胞增殖均上調(diào)。熱圖顯示，用5% cts處理的細(xì)胞中合成代謝基因（col27a1，col6a3，col4a4等）上調(diào)，表明5% cts對afcs有益。
為了闡明cts誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)背后的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在cts刺激后直接檢查了兩種力學(xué)敏感蛋白cav1和整合素β1的水平。顯然，cav1和整合素β1的表達(dá)在5% cts組中下調(diào)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞對物理信號的敏感性降低。相比之下，12% cts顯著增加了這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖3 a、b）。通過免疫熒光檢測cav1蛋白表達(dá)的細(xì)胞定位。有趣的是，cav1出現(xiàn)在afcs的細(xì)胞質(zhì)膜上，并且在cts為 5% 或12% 時核cav1 沒有進(jìn)一步增加（圖3 c）。同樣，整合素β1在靜態(tài)和機(jī)械條件下也位于細(xì)胞質(zhì)膜上（圖3 d）?，F(xiàn)在，這兩種力學(xué)敏感蛋白在任何應(yīng)力刺激條件下總是存在于afcs的細(xì)胞質(zhì)膜上，它們可能會通過下游的細(xì)胞內(nèi)信號通路將外部力學(xué)線索轉(zhuǎn)化為特定的生物信號。p65細(xì)胞核易位在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)促炎反應(yīng)中起重要作用。根據(jù)免疫熒光結(jié)果，p65在靜態(tài)和5% cts條件下位于細(xì)胞質(zhì)中，但在12% cts條件下迅速易位到細(xì)胞核中（圖3 e）。這些數(shù)據(jù)表明，這兩種蛋白質(zhì)可能參與cts誘導(dǎo)的afc炎癥反應(yīng)，其功能可能依賴于p65的細(xì)胞核易位。
圖3 cts處理的afcs中cav1和整合素β1的表達(dá)變化。
（a、b）不同力學(xué)條件下afcs中cav1和整合素β1蛋白表達(dá)的變化。（c-e）不同力學(xué)條件下cav1、整合素β1和p65在afcs中的定位。
為了確定cav1參與過度cts誘導(dǎo)的炎癥，使用小干擾rna（sirna）雙鏈體來抑制afcs中的cav1。結(jié)果表明，12% cts處理的afcs中敲低cav1導(dǎo)致促炎基因水平降低。隨后過表達(dá)cav1，這增加了p65磷酸化（p-p65）的蛋白質(zhì)水平。p-p65 是p65活化的指標(biāo)，并作為nf-κb信號通路的主要轉(zhuǎn)錄因子。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，響應(yīng)cav1過表達(dá)，p65在細(xì)胞核中迅速積累。接下來進(jìn)一步證實(shí)cav1在適度cts表現(xiàn)出的抗炎效應(yīng)中的作用，rt-qpcr數(shù)據(jù)顯示，cav1的過表達(dá)消除了5% cts誘導(dǎo)的抗炎作用，并導(dǎo)致促炎基因的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，cav1可能是一個關(guān)鍵的力學(xué)敏感因子，它通過調(diào)節(jié)p65核易位和下游炎癥信號來調(diào)節(jié)cts處理的afcs的炎癥反應(yīng)。
cav1直接與整合素β1相互作用
先前的研究表明，cav1和整合素β1之間的相互調(diào)控依賴于不同的基質(zhì)剛度的變化?；谏鲜鼋Y(jié)果，研究人員假設(shè)cav1可能在外部力學(xué)線索誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)期間連接整合素β1。為了驗(yàn)證假設(shè)，首先應(yīng)用免疫熒光染色來追蹤兩種蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染pex4-cav1和pcdna3.1-整合素β1質(zhì)粒的afcs中的位置。在該實(shí)驗(yàn)中，cav1和整合素β1在afcs的細(xì)胞質(zhì)中共定位（圖4 a）。然后，用pex4-cav1或pcdna3.1-整合素β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染afcs，以誘導(dǎo)cav1或整合素β1過表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡測定顯示，分別轉(zhuǎn)染pex4-cav1或pcdna3.1-整合素β1質(zhì)粒的afcs中整合素β1或cav1蛋白水平顯著上調(diào)。根據(jù)上述結(jié)果，預(yù)測這兩種力學(xué)敏感蛋白之間存在一定的關(guān)系。
為了確定cav1和整合素β1是否直接相互作用，用pex4-cav1或pcdna3.1-整合素β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染afcs，然后進(jìn)行免疫共沉淀（co-ip）以驗(yàn)證它們的關(guān)系。事實(shí)上，整合素β1被抗-cav1抗體沉淀（圖4 b），而cav1也可能被抗-整合素β1抗體沉淀（圖4 c）。然而，p65不能被cav1或整合素β1抗體沉淀，這表明p65核易位受上述力學(xué)敏感蛋白間接調(diào)控的。這些結(jié)果支持，cav1和整合素β1可以直接相互作用，這兩種蛋白質(zhì)可能在外部力學(xué)線索誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用。
圖4 cav1和整合素β1之間的相互作用。
（a）轉(zhuǎn)染有（過表達(dá)組）或不含（ctrl組）pex4-cav1和pcdna3.1-整合素β3質(zhì)粒的afc中cav1（紅色），整合素β1（綠色）和dapi（藍(lán)色）的免疫熒光圖像。在轉(zhuǎn)染有pex4-cav1（b）或pcdna3.1-整合素β1（c）質(zhì)粒的afc中進(jìn)行共co-ip 測定。
為了進(jìn)一步研究通過動態(tài)牽引力恢復(fù)退行性椎間盤的可行性，對輕度椎間盤退變大鼠（壓縮處理）的尾椎每隔一天用適度牽引力刺激2小時，持續(xù)2周。與假手術(shù)組相比，椎間盤高度和 np 含水量降低。同時分析每組椎間盤的形態(tài)變化，af的膠原纖維排列得波浪狀，更多的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)在af區(qū)域。2周后，np含水量恢復(fù)，動態(tài)牽引力后椎間盤的典型形態(tài)恢復(fù)?？偟膩碚f，與釋放組的大鼠相比，牽引后的退行性椎間盤顯示出更好的恢復(fù)。
此外，進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色測定，以分析來自不同組的每個椎間盤af中cav1，p-p65，cox-2和膠原蛋白i的表達(dá)。數(shù)據(jù)表明，cav1，p-p65和cox-2的表達(dá)在壓縮刺激的椎間盤中上調(diào)，但在適度牽引力刺激處理的椎間盤中顯著降低。然而，在適度機(jī)械刺激處理的椎間盤中，膠原蛋白i的表達(dá)呈相反趨勢，表達(dá)水平較高，代表退行性椎間盤的一種代償性修復(fù)。與體外結(jié)果一致，適度的機(jī)械刺激可能對退行性椎間盤的修復(fù)有益，這可能依賴于 cav1 介導(dǎo)的信號通路。
圖5 總之，適度的力學(xué)刺激抑制了cav1介導(dǎo)的信號通路，并對afcs表現(xiàn)出抗炎作用。結(jié)合體內(nèi)結(jié)果，闡明了適度應(yīng)力刺激對椎間盤（ivd）影響的潛在分子機(jī)制，可為ivd退變的治療提供新的治療策略。
在這項(xiàng)研究中，通過體外和體內(nèi)模型研究了力學(xué)負(fù)荷在細(xì)胞和組織水平上對椎間盤的影響。研究發(fā)現(xiàn)過度的牽引力負(fù)荷（12% cts）抑制了afc的增殖和遷移，并增加了炎癥基因的表達(dá)水平。相反，適度機(jī)械負(fù)荷（5% cts）通過抑制cav1介導(dǎo)的整合素β1和nf-κb信號通路來挽救炎癥反應(yīng)并增強(qiáng)afc增殖，遷移和ecm合成。此外，體內(nèi)結(jié)果表明，適度的力學(xué)刺激可以恢復(fù)np的含水量，加速退行性椎間盤的重建。綜上所述，這項(xiàng)研究可能會促進(jìn)理解生理等效刺激對細(xì)胞的抗炎作用的進(jìn)展，并為ddd的物理療法的創(chuàng)新設(shè)計(jì)提供可能性。
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