化學(xué)試劑：丙烯酰胺acrylamide，c3h5no，cas: 79-06-1 建議的內(nèi)標(biāo)：d3-丙烯酰胺
色譜流動相的制備：流動相a：在1 l hplc級的水中，加入10 µl甲酸。 流動相b：在1 l hplc級的甲醇中，加入10 µl甲酸。
樣品制備試劑 ：carrez reagentⅰ k4fe(cn)6 • 3h2o。 carrez reagentⅱ (七水合硫酸鋅) znso4 • 7h2o。
洗脫液的制備： carrez 試劑?。喝芙?7.5 g k4fe(cn)6•3h2o于250 ml hplc級的水中。 carrez 試劑ⅱ：溶解 75 g znso4 • 7h2o于250 ml hplc級的水中。
樣品制備 ：基于buhlert和hartig等人提出的方法[1，2]： 1. 稱量5 ml勻漿的樣品； 2. 加入50 ml環(huán)己烷 / 丁基甲基醚 ( 95 / 5 ) 混合溶液進(jìn)行脫脂； 3. 空氣干燥； 4. 加入500 µl內(nèi)標(biāo)d3-丙稀酰胺溶液 ( 10 µg/ml, 溶解于 hplc級的水中)，得到內(nèi)標(biāo)濃度約為10 ng/ml的溶液； 5. 加入95 ml hplc級的水，40 ℃超聲提取10 min (溶液中加入剪成碎片的過濾紙)； 6. 加入2.5 ml carrez 試劑ⅰ和2.5 ml carrez 試劑ⅱ，進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀； 7. 過濾并離心； 8. 如果需要沉淀*，將溶液冷卻至 -18 ℃，然后迅速暖至室溫，離心； 9. 用水稀釋上清液(稀釋比例1 / 4 , v/v)。
基于tareke等人提出的方法[3]： 1. 稱量10 g勻漿的樣品； 2. 加入100 ml水，和100 µl內(nèi)標(biāo) d3-丙稀酰胺 (10 µg/ml，溶解于hplc級的水中)； 3. 于12 ml pyrex 玻璃離心管中進(jìn)行離心； 4. 14000 r/min離心10 min，上清液移入兩支eppendorf管中； 5. 用乙腈活化固相提取柱，然后用水清洗(2×2 ml) (多模式分離，300 mg，international sorbent technology 有限公司)； 6. 棄去開始的1 ml濾液； 7. 其他的洗脫液，用0.45 µm 濾膜進(jìn)行過濾； 8. 用 500 µl超濾器 (microcon ym-3, millipore)，14000 r/min 離心10 min進(jìn)行超濾，接收200 µl濾液。
基于jürgen buhlert (cvua sigmaringen, 德國) 提出的方法（牛奶基質(zhì)）： 1. 用5倍的水稀釋樣品 (v/v)； 2. 加入內(nèi)標(biāo)d3-丙稀酰胺 ； 3. 用carrez試劑ⅰ和ⅱ進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀； 4. 過濾； 5. 在lc-ms/ms進(jìn)樣前，每1 ml上清液中加入4 µl 甲酸。
色譜分離條件 agilent 1100 系統(tǒng)：g1312a二元泵系統(tǒng)、g1367a型自動進(jìn)樣器、柱溫箱。 色譜柱[2]：1. phenomenex luna，3 µm，c18，150 mm×3 mm，基質(zhì)較簡單時*使用； 2. thermo electron hypercarb，5 µm，100 mm×3 mm，基質(zhì)較簡單時*使用 (例如可可飲料，全麥面包等) 。 流動相：a相—水 + 0.1% 甲酸；b相—甲醇 + 0.1%甲酸。
ms/ms 檢測 api 3200™或3200 qtrap® lc-ms/ms液質(zhì)分析系統(tǒng)。turboionspray 離子源、正離子方式、mrm掃描 方式。