人肝臟類器官培養(yǎng)手冊
背景介紹肝臟是人體中最大的器官之一，來源于內(nèi)胚層中前腸上皮細胞發(fā)育而來的肝芽結(jié)構(gòu)，以代謝功能為主，發(fā)揮“解毒”作用。肝功能失衡會導致稱為肝衰竭的病理狀況，并導致肝炎、纖維化、肝硬化、癌癥、代謝或自身免疫性疾病。因此，為充分了解每種肝病的表型和損傷器官的機制，我們需要體外個性化肝模型系統(tǒng)進行疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物毒性學習。
肝臟類器官(hepatic organoids, hlo, ho)是肝臟功能的3d模型，保留了肝細胞的主要生理特征。在存在或不存在基質(zhì)的情況下，可以從ipsc、esc或特定的成體細胞（例如上皮細胞或上皮細胞和間充質(zhì)細胞）生成類器官。
肝臟類器官的培養(yǎng)方案我們根據(jù)jci insight[1]、cell metab[2]和j hepatol[3]發(fā)表的三篇文章，整理了由人類誘導多能干細胞(human ipscs)生成肝臟類器官的培養(yǎng)方案。
圖1.ipsc分化為肝類器官的過程(pmid: 28878125)[1]
a：ipsc分化為肝類器官的示意圖；b-c：在第0天(ipscs)、第3天（定形內(nèi)胚層，en）、第6天（前腸，fg）、第9天（成肝細胞，hb)、第20天(ho1)和第62天(ho2)在ho發(fā)育過程中發(fā)生的形態(tài)學和細胞標記變化。
誘導定型內(nèi)胚層ipsc在含有5 mm edta和10 mm y-27632的緩沖液解離為單個細胞，接種到低吸附的6孔板上，然后用含有激活素a (100 ng/ml)和bmp4 (10 ng/ml)的rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3天；
誘導前腸球體更換為含有2% matrigel和b27的rpmi培養(yǎng)基；第3 -6天，培養(yǎng)基中加入50 ng/mlfgf10；第6-9天，培養(yǎng)基中加入10 ng/mlfgf10和10 ng/mlbmp4；
誘導類器官第9天后，更換為含有1% matrigel、50 ng/mlhgf、50 ng/mloncostatin m和10 μm dexamethasone的類器官生長和分化培養(yǎng)基(hcm)中。
圖2.ipsc分化為肝類器官的過程(pmid: 31155493)[2]
a：ipsc分化為肝類器官的示意圖；b：在第0天(ipscs)和第20天(hlo)明場圖像。
類器官擴增在第20天收集培養(yǎng)物，將細胞解離，200 g離心3 min收集細胞，重懸于50 μl gfr-matrigel中，接種到24孔板中。matrigel凝固后，加入1ml生長培養(yǎng)基(rpmi-1640, b27, 250 nm ldn-193189, 3 μm chir99021, 10 μm a83-01, 100 ng/mlegf, 10 ng/mlfgf10和20 ng/mlhgf)，培養(yǎng)細胞6天，更換為分化培養(yǎng)基(hcm medium, 10 μm dapt, 10 ng/mloncostatin m, 20 ng/mlhgf, 10 μm dexamethasone, 10 ng/mlbmp4)再培養(yǎng)6天。
相關(guān)產(chǎn)品
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品編號
規(guī)格
簡介
y-27632
53006es
1mg/5 mg/10 mg
rock抑制劑
chir99021
53003es
2mg/5 mg/10 mg
gsk-3α/β抑制劑
dexamethasone地塞米松
53269es
250 mg/500 mg/1 g
糖皮質(zhì)激素受體激動劑
ldn193189
53012es
5 mg/10 mg
bmp信號通路抑制劑
a 83-01
53002es
1mg/5 mg/10 mg
tgf-β信號抑制劑
dapt
52104es
10 mg/50 mg
notch通路抑制劑
human bmp4
92053es
10μg/100μg/500μg
重組蛋白
human egf
92708es
100μg/500μg
重組蛋白
human activin a
91702es
10μg/100μg/500μg
重組蛋白
human fgf4
91303es
5μg/100μg/500μg
重組蛋白
human fgf10
91306es
5μg/100μg/500μg
重組蛋白
human hgf
92055es
10μg/50μg/1mg
重組蛋白
human oncostatin m
92254es
10μg/100μg/500μg
重組蛋白
n-2 supplement,serum free,100x
60706es
5 ml
用于細胞和組織體外培養(yǎng)
hepes溶液(1 m)，細胞培養(yǎng)級
60117es
100 ml
化學緩沖劑
sodium pyruvate丙酮酸鈉
60370es
10 g/100 g
抗氧化
bsa牛血清白蛋白,診斷級別
36102es
25 g/100 g/500 g/1 kg
用于細胞培養(yǎng)
50× b-27無血清添加劑，去除維生素a
60704es
10 ml
無血清添加劑
參考文獻[1]guan y, et al. human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. jci insight
. 2017 sep 7;2(17):e94954.
[2]ouchi r, et al. modeling steatohepatitis in humans with pluripotent stem cell-derived organoids. cell metab. 2019 aug 6;30(2):374-384.e6.
[3]mun sj, et al. generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. j hepatol. 2019 nov;71(5):970-985.