活性氧檢測試劑盒的背景與應(yīng)用及操作步驟！
一、背景
活性氧檢測試劑盒是一種基于熒光染料dcfh-da的熒光強度變化，定量檢測細胞內(nèi)活性氧水平的試劑盒。
dcfh-da本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成dcfh。而dcfh不能通透細胞膜，從而使探針很容易被標(biāo)記到細胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下，dcfh被氧化生成熒光物質(zhì)dcf，綠色熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比，檢測dcf的熒光就可以知道細胞內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長502nm，發(fā)射波長530nm附近，使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀、流式細胞儀等檢測dcf熒光，從而測定細胞內(nèi)活性氧水平。
活性氧(ros)包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。
二、活性氧檢測試劑盒操作步驟
1、裝載探針
對于刺激時間較短(通常為2小時以內(nèi))的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長(通常為6小時以上)的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。
2、原位裝載探針(僅適用于貼壁細胞)
細胞準(zhǔn)備：檢測前一天進行細胞鋪板，確保檢測時細胞匯合度達到50～70%。
探針準(zhǔn)備：探針裝載前按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋dcfh-da，使其終濃度為10μm。
探針裝載：吸除細胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的dcfh-da工作液。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，如，對于6孔板通常不少于1000μl，對于96孔板通常不少于100μl。37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20～30min。
細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的dcfh-da。
藥物誘導(dǎo)：加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時間根據(jù)藥物本身特性，以及細胞類型來決定。
(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000稀釋陽性對照(rosup,50mg/ml)，加入細胞，一般37℃避光孵育20～30min可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。(如，hela細胞孵育30min；mrc5人胚胎成纖維細胞1.5h)
3、收集細胞后裝載探針(適用于貼壁細胞和懸浮細胞)
細胞準(zhǔn)備：按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細胞，必須保證檢測用細胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法，清洗并收集足量的細胞。
探針準(zhǔn)備：探針裝載前，按照1:1000用無血清培養(yǎng)液稀釋dcfh-da，使其終濃度為10μm。
探針裝載：細胞收集后懸浮于加入適當(dāng)體積稀釋好的dcfh-da工作液，使其細胞密度為1.0×106～2.0×107/ml，37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20～30min，每隔3～5min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。
注：細胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測體系，檢測方法，以及檢測總量來進行調(diào)整。如，對于流式分析，單管檢測內(nèi)細胞數(shù)目不少于104，也不可多于106。
細胞清洗：用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的dcfh-da。
藥物誘導(dǎo)：將細胞懸浮于適量經(jīng)合適的緩沖液或無血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物中，或把細胞等分成若干份后再進行藥物刺激，于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育，具體誘導(dǎo)時間根據(jù)藥物本身特性，以及細胞類型來決定。
(可選)陽性對照：先用無血清培養(yǎng)基等1:1000稀釋陽性對照(rosup,50mg/ml)，加入細胞，一般37℃避光孵育20～30min可顯著看到活性氧水平提高，但依細胞類型會有比較明顯差異。(如，hela細胞孵育30min；mrc5人胚胎成纖維細胞1.5h)。
4、檢測
原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀檢測。
收集細胞后裝載探針：用熒光分光光度計、熒光酶標(biāo)儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
5、參數(shù)設(shè)置
使用488nm激發(fā)波長，525nm發(fā)射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。dcf的熒光光譜和fitc非常相似，可以用fitc的參數(shù)設(shè)置檢測dcf。
三、應(yīng)用
活性氧檢測試劑盒可以用于微囊藻毒素-lr對中國倉鼠卵巢細胞的氧化應(yīng)激和凋亡作用：
以中國倉鼠卵巢(cho)細胞為模型,經(jīng)mc-lr暴露后,檢測cho細胞活性的變化,及細胞內(nèi)活性氧、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化水平,線粒體膜電位,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性和細胞凋亡率的變化,從分子水平探討mc-lr對cho細胞的毒性作用,為闡明mc-lr的生殖毒性作用提供理論基礎(chǔ)。
方法：
1、建立傳代培養(yǎng)的cho細胞模型。
2、用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,mtt)比色法檢測mc-lr對cho細胞活性的影響：不同濃度的mc-lr(0μg/ml,1μig/ml,5μg/ml,10μg/ml15μg/ml)處理cho細胞24h后,用mtt染色,測各組吸光度,計算細胞活性。
3、集落形成實驗：用不同濃度的mc-lr(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)處理cho細胞24h,計算各組集落形成能力,評價mc-lr對單個cho細胞增殖能力的影響。4.檢測mc-lr對cho細胞中過氧化氫酶(cat)、丙二醛(mda)、活性氧(ros)的影響：用不同濃度的mc-lr(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理cho細胞,24h后收集細胞,用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(dcfh-da)法測定ros,硫代酸(tba)法測定mda,可見分光光度法測定cat。
4、線粒體膜電位檢測試劑盒檢測不同劑量mc-lr(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m1)染毒24h后cho細胞線粒體膜電位的變化。
5、caspase-3底物切除法檢測mc-lr(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)對cho細胞中caspase-3性的影響。
6、膜聯(lián)蛋白v-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin v-fitc/pi)雙染色結(jié)合流式細胞術(shù)檢測不同濃度的mc-lr(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后細胞凋亡率的變化。
結(jié)果：
1、mc-lr(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)處理cho細胞24h后,mtt法檢測結(jié)果顯示隨著毒素濃度升高,細胞形態(tài)逐漸改變,細胞活性逐漸降低。且與對照組相比,5μg/ml、10μg/ml和15gg/ml染毒組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。集落形成實驗中隨著染毒濃度增加,集落形成能力下降,與上述結(jié)果一致,也證明mc-lr能抑制cho細胞活性。