我們的amplite™熒光caspase 3/7檢測(cè)試劑盒使用ac-devd-amc作為caspase 3/7活性的熒光指示劑。amc肽幾乎不發(fā)熒光。 caspase 3/7對(duì)amc肽的切割產(chǎn)生強(qiáng)熒光amc，其在440-460nm下熒光監(jiān)測(cè)，激發(fā)340-350nm。 它可用于使用熒光酶標(biāo)儀或熒光計(jì)連續(xù)測(cè)量細(xì)胞提取物和純化酶制劑中caspase 3/7的活性。百螢生物是aat bioquest 的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的caspase 檢測(cè)試劑/試劑盒。
產(chǎn)品適用儀器
熒光酶標(biāo)儀
ex：350nm em:450nm cutoff:420nm
推薦孔板：純黑色孔板
實(shí)驗(yàn)方案
96孔板測(cè)定示例
概述
用測(cè)試化合物制備細(xì)胞（100μl/孔用于96孔板或25μl/孔用于384孔板）
加入等體積的caspase 3/7測(cè)定溶液
在室溫下孵育1小時(shí)
監(jiān)測(cè)ex的熒光強(qiáng)度 / em = 350 / 450nm
操作方法
1.準(zhǔn)備細(xì)胞：
1.1對(duì)于貼壁細(xì)胞：在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中將細(xì)胞在20,000至80,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 90l過(guò)夜，96孔板或5,000至20,000個(gè)細(xì)胞/孔/ 20l，用于384孔板。
1.2對(duì)于非粘附細(xì)胞：從培養(yǎng)基中離心細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀懸浮于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基濃度為80,000至200,000細(xì)胞/孔/ 90l，用于96孔poly-d賴氨酸平板或20,000至50,000細(xì)胞/孔/ 20l用于384孔聚-d賴氨酸板。在實(shí)驗(yàn)之前，在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下以800rpm離心板2分鐘。
注意：應(yīng)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行單獨(dú)評(píng)估，以確定誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的佳細(xì)胞密度。
2.準(zhǔn)備庫(kù)存解決方案：
2.1在使用前，在室溫下使用組分a，b，c（如果需要，組分d）。
2.2如果需要，制備1mm caspase 3/7抑制劑ac-devd-cho儲(chǔ)備液：將100μldmso（未提供）直接加入到caspase 3/7抑制劑ac-devd-cho小瓶中（組分d） ）。該抑制劑可用于確認(rèn)熒光信號(hào)強(qiáng)度與caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。
注意：應(yīng)將未使用的抑制劑儲(chǔ)備液等分并在-20°c下干燥儲(chǔ)存。
3.準(zhǔn)備caspase 3/7檢測(cè)溶液：
將50μl200xcaspase 3/7底物儲(chǔ)備溶液（組分a）和100μl1mdtt溶液（組分c）加入10ml測(cè)定緩沖液（組分b）中，并充分混合。
注意：50μl的200x caspase 3/7底物儲(chǔ)備液足以進(jìn)行100次分析，每次分析的反應(yīng)體積為100μl。未使用的200x caspase 3/7底物儲(chǔ)備溶液應(yīng)等分并在-20°c下干燥儲(chǔ)存。遠(yuǎn)離光明。
4.運(yùn)行caspase 3/7測(cè)定：
4.1通過(guò)在pbs或所需緩沖液中加入10μl10x測(cè)試化合物（96孔板）或5μl5x測(cè)試化合物（384-板）來(lái)處理細(xì)胞。對(duì)于空白孔（沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基），加入相應(yīng)量的化合物緩沖液。
4.2將細(xì)胞板在37℃，5％co 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所需的一段時(shí)間（用喜shu堿處理的jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
4.3加入100μl/孔（96孔板）或25μl/孔（384孔板）的caspase 3/7測(cè)定溶液（來(lái)自步驟3）。
4.4在室溫下孵育板至少1小時(shí)，避光。
注1：如果需要，在室溫下加入測(cè)定溶液10分鐘前，將1l caspase 3/7抑制劑ac-devd-cho的1mm儲(chǔ)備液（來(lái)自步驟2.2）加入所選樣品，以確認(rèn)caspase 3 / 7個(gè)類似的活動(dòng)。
4.5在制動(dòng)器關(guān)閉的情況下，以800rpm離心細(xì)胞板（特別是對(duì)于非貼壁細(xì)胞）2分鐘。
4.6在ex / em = 350 / 450nm處觀察熒光增加。
圖1。ta 嵌合體對(duì)脂質(zhì)體 dox 介導(dǎo)的半胱天冬酶3/7活化的影響。將 hela m (a)和 bewo (b)細(xì)胞與含有或不含摻入 ta 蛋白的 dox 載脂質(zhì)體一起溫育。培養(yǎng)48小時(shí)后測(cè)定半胱天冬酶3和7的活性。顯示的值表示為使用未處理的單元格獲得的值的百分比。誤差棒對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3) ，獲得的值相對(duì)于無(wú)蛋白質(zhì) dox 負(fù)載的脂質(zhì)體的顯著性是通過(guò)單因素方差分析測(cè)試(* 表示 p < 0.05)確定的。來(lái)源: 牛蛙卵中的唾液酸結(jié)合凝集素在體外和體內(nèi)抑制人類間皮瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，takeo tatsuta 等人，公共科學(xué)圖書(shū)館，2018年1月。
圖2。ona 對(duì)小鼠腫瘤進(jìn)展的影響。作為小鼠卵巢癌模型，c57b6小鼠在右側(cè)卵巢中注射 imoc 細(xì)胞并施用 ona (20mg/kg) ，如示意圖(a)所示。大多數(shù)未經(jīng)處理的 c57b6小鼠在第40天死于癌癥轉(zhuǎn)移。評(píng)估存活時(shí)間(b)和腫瘤重量(c，比例尺: 1厘米)。使用免疫染色評(píng)估 stat3活化(d，比例尺: 20μm) ，半胱天冬酶 -3活化(e，比例尺: 200μm)和巨噬細(xì)胞(f)在腫瘤組織中的浸潤(rùn)。報(bào)道了 iba-1陽(yáng)性巨噬細(xì)胞中 f4/80陽(yáng)性細(xì)胞和 cd163陽(yáng)性細(xì)胞的百分比(f)。然后，將裸鼠在腹腔內(nèi)注射 es2細(xì)胞并給予 ona (20mg/kg) ，如示意圖(g)所示，然后測(cè)定存活率(g)。大多數(shù)未經(jīng)治療的裸鼠在第20天死于癌癥轉(zhuǎn)移。來(lái)源: 洋蔥素 a 通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞的腫瘤功能來(lái)抑制卵巢癌的進(jìn)展。
圖3。ona 聯(lián)合抗癌藥物對(duì) eoc 細(xì)胞的聯(lián)合作用。將 eoc 細(xì)胞(skov3，es2和 rmg1)與單個(gè)抗癌藥物(ptx，cbdca 或 cddp)和 ona 的無(wú)效濃度的組合溫育24小時(shí)，然后使用 wst-8測(cè)定法(a)測(cè)定細(xì)胞增殖，并確定每種抗癌藥物對(duì)每個(gè)細(xì)胞系的無(wú)效濃度。此外，eoc 細(xì)胞與抗癌藥物和 ona 一起溫育4小時(shí)，然后進(jìn)行半胱天冬酶 -3測(cè)定(b)。數(shù)據(jù)以平均值 ± sd 表示。* 與對(duì)照相比，p 值 < 0.05，* * p 值 < 0.01(不含抗癌藥物)。此外，將每種 eoc 細(xì)胞系(skov3: c，es2: d 和 rmg1: e)與含有或不含 ona 的每種抗癌藥物(ptx，cbdca 和 cddp)的無(wú)效濃度一起溫育3小時(shí)，然后通過(guò) western 印跡分析測(cè)量 pstat3，stat3和 β-肌動(dòng)蛋白，如材料和方法中所述。來(lái)源: 洋蔥素 a 通過(guò)抑制癌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞的腫瘤功能來(lái)抑制卵巢癌的進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：熒光酶標(biāo)儀 酶標(biāo)儀 制動(dòng)器 培養(yǎng)箱