熒光定量pcr（real-time pcr），是指在pcr擴增反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過對擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。定量pcr方法：
1、競爭法選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化pcr產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。2、內(nèi)參照法在不同的pcr反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在pcr產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。3、pcr－elisa法利用di高辛或生物su等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗di高辛或生物su酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的pcr－elisa法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。