pcr反應(yīng)五要素：參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dntp、模板和mg2+。
1、引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以zui低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。
2、酶及其濃度 目前有兩種taq dna聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的pcr反應(yīng)約需酶量2.5u(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3、dntp的質(zhì)量與濃度 dntp的質(zhì)量與濃度和pcr擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dntp粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dntp溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1mnaoh或1mtris。hcl的緩沖液將其ph調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dntp降解。在pcr反應(yīng)中，dntp應(yīng)為50～200umol/l，尤其是注意4種dntp的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會引起錯(cuò)配。濃度過低又會降低pcr產(chǎn)物的產(chǎn)量。dntp能與mg2+結(jié)合，使游離的mg2+濃度降低。
4、模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是pcr成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的dna純化方法通常采用sds和蛋白酶k來消化處理標(biāo)本。sds的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，sds還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶k能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與dna結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于pcr反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于pcr擴(kuò)增。rna模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。
5、mg2+濃度 mg2+對pcr擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的pcr反應(yīng)中，各種dntp濃度為200umol/l時(shí)，mg2+濃度為1.5～2.0mmol/l為宜。mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低taq dna聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。