實(shí)時(shí)熒光定量pcr（quantitative real-time pcr）簡稱qpcr，是一種在dna擴(kuò)增體系中加入熒光基團(tuán)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）循環(huán)實(shí)現(xiàn)熒光信號的積累，從而實(shí)現(xiàn)檢測每次pcr循環(huán)后產(chǎn)物總量的一種方法，是核酸檢測和定量分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
技術(shù)原理
實(shí)時(shí)熒光定量pcr根據(jù)所使用的熒光標(biāo)記方法可分為兩種：熒光染料（sybr green i染料為主）和熒光探針（taqman探針）。
①sybr green i染料法
sybr green i染料是一種結(jié)合于所有雙鏈dna雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。這種染料在反應(yīng)體系中處于游離狀態(tài)時(shí)，發(fā)出的熒光極其微弱，但當(dāng)其與dna雙鏈結(jié)合的時(shí)候，熒光信號就會(huì)被放大，從而被儀器所檢測。在pcr實(shí)驗(yàn)中，染料的結(jié)合量與dna的濃度呈現(xiàn)正比關(guān)系，所以我們可以通過檢測熒光信號的強(qiáng)度來反映pcr體系中dna的濃度。
優(yōu)點(diǎn)：可用于檢測任何雙鏈dna序列的擴(kuò)增，無需單獨(dú)設(shè)計(jì)探針，操作簡單，成本較低。
②taqman探針法
taqman熒光探針是進(jìn)行熒光檢測的另一種方法。taqman熒光探針是由5’端的熒光報(bào)告基團(tuán)、3‘端的熒光淬滅基團(tuán)和靶基因特異性結(jié)合的序列構(gòu)成。當(dāng)探針在反應(yīng)體系中處于游離狀態(tài)時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)的信號會(huì)被熒光淬滅基團(tuán)所吸收。但當(dāng)pcr進(jìn)行到退火、延伸階段時(shí)，dna聚合酶會(huì)將熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光，因此探針法也可以通過檢測熒光信號強(qiáng)度來反應(yīng)pcr體系中dna的濃度。
優(yōu)點(diǎn)：熒光探針只與目的序列結(jié)合，具有良好的特異性，無需實(shí)驗(yàn)優(yōu)化；不同波長的熒光報(bào)告基團(tuán)可以標(biāo)記不同的探針，兼容多重反應(yīng)。
常見術(shù)語：
ct值：c代表cycle，t代表threshold，即指qpcr在擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所對應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。
惰性參比染料（rox）：用作熒光信號標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照，可以逐孔校正因移液不準(zhǔn)確、孔位置及熒光波動(dòng)造成的變動(dòng)。
擴(kuò)增曲線：amplification curve ，隨著pcr反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號強(qiáng)度隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加逐漸增強(qiáng)，通過熒光強(qiáng)度來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的變化。
擴(kuò)增效率：一個(gè)dna分子擴(kuò)增為2個(gè)dna分子，這種情況下的擴(kuò)增效率為100。實(shí)際上會(huì)出現(xiàn)偏高和偏低的情況，90-110%之間。
溶解曲線：melting curve，是指擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，對雙鏈dna進(jìn)行升溫處理，此時(shí)，dna雙鏈逐漸解開，染料脫落，熒光值下降，熒光值隨溫度變化的曲線即“溶解曲線”，可用來判斷體系中是否含有引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。
ntc：無模板對照（no template control），是指擴(kuò)增反應(yīng)中，模板通常用水來代替，用于檢測試劑污染或外源dna造成的污染。
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