甘磷酸膽堿的理化性質與生物學功能及制備方法！
一、背景及概述
甘油磷酸膽堿( gpc)，是人體內正常存在的水溶性小分子物質，是重要的神經傳遞介質乙酰膽堿( acetylcholine) 的生物合成前體。gpc 最重要的作用在于其產生的膽堿為水溶性族，對大腦和神經系統(tǒng)具有重要作用，研究顯示gpc 對某些激素和神經傳遞介質如乙酰膽堿和人生長激素的產生具有重要作用，由此支持大腦和神經系統(tǒng)的功能。
在體內，gpc 最重要的生理功能在于穿過血腦屏障，為乙酰膽堿和磷脂( pc) 的合成提供必要的膽堿，乙酰膽堿是中樞神經系統(tǒng)中重要的神經傳遞介質，幫助腦部完成學習、記憶和認知活動，且能控制淺睡眠和肌動活動。直接服用gpc，能夠促進腦部磷酸肌醇的形成，并增加腦部磷脂的合成數量，為中樞神經內的信號傳遞提供更多的磷脂化合物，增加體內磷脂酰膽堿的合成數量，有助于抵抗年齡增長而引起的細胞膜受損和末梢神經功能的衰退。gpc 在意大利上市，近幾年，gpc 在我國引起越來越多的關注。
二、理化性質
gpc分子式為c8h20no6p，可與水混溶，能溶于甲醇、乙醇，不溶于氯仿、醚、油等，在紫外可見光下無特征吸收。gpc 含量測定方法有高效液相色譜法( 配備蒸發(fā)光散射檢測器或折光示差檢測器) 和消化定磷法。常用的別方法有tlc 法( 展開劑為： v( ch2cl2) ∶ v( h2o) ∶ v( 三乙胺) = 35 ∶ 60 ∶ 5或v ( chcl3) ∶ v ( ch3oh ) ∶ v ( ch3cooh ) ∶v( ch3ch2cho) ∶ v( h2o) = ( 45∶ 25∶ 7∶ 4∶ 2) ) 、化學鑒別法( 配制5% 的gpc 供試品溶液，加入一定量的氫氧化鈉溶液和高錳酸鉀溶液，加熱，有類似三甲胺臭氣產生，此氣體使?jié)駶櫟募t色石蕊試紙變藍) 和紅外吸收光譜圖鑒別法。采用核磁共振譜對gpc 進行結構分析，得到了gpc 的h 譜、c 譜、dept 譜、hsqc 譜、cosy 譜、hmbc 譜以及p譜的檢測數據，得到gpc 的結構及化學位移歸屬見圖。
三、安全性
甘油磷酸膽堿是人體內的內源性物質，在2009年的《突變研究》雜志刊登了480 種測試銷售藥物的遺致癌性和遺傳毒性，甘油磷酸膽堿列于“ 沒有檢索到數據的藥品”類。它不具有生殖毒性、遺傳毒性和致癌性。在對2 000 多例患者進行臨床前試驗時，發(fā)現總共出現了不良反應40 多例（ 2.14%），本品的臨床不良癥狀主要有：胃有灼熱感、興奮、失眠、頭痛；個別患者出現嘔吐、腹瀉、意識模糊、頭暈、猝倒等癥狀；但總體看來甘油磷酸膽堿的安全性良好。
四、耐受性
根據多個中心的臨床試驗使用甘油磷酸膽堿對阿爾茨海默氏癥和多發(fā)性腦梗死性癡呆患者進行分別研究治療。甘油磷酸膽堿治療阿爾茨海默氏癥療程為180 d，每次0.4 g，每天服用3 次藥。結果顯示，甘油磷酸膽堿治療阿爾茨海默氏癥療效明顯，并且患者對于甘油磷酸膽堿的耐受性較好；甘油磷酸膽堿在治療多發(fā)性腦梗死性癡呆方面的研究，在對120 多例輕度病情的多發(fā)性腦梗死性癡呆患者進行試驗，療程為80 d，每同肌肉注射甘油磷酸膽堿1 g。
結果顯示甘油磷酸膽堿對于多發(fā)性腦梗死性癡呆，患者的耐受性較好。使用甘油磷酸膽堿治療腦缺血性中風、輕度多發(fā)性腦梗死型癡呆、輕度阿爾茨海默癥，無局部或者全身的重大不良反應。沒有臨床上和統(tǒng)計上的生命體征（舒張壓、收縮壓和心率）也沒有任何實驗室檢查參數的明顯變化。所以，甘油磷酸膽堿的耐受性良好。
五、生物學功能
甘油磷酸膽堿不僅是腎髓質細胞的主要滲透物之一，而且能夠平行的改變細胞內外滲透物質的濃度。這對于腦血管的健康，尤其是有益于因大腦衰退而引起的行為和情感障礙。甘油磷酸膽堿具有對于多種生化病變進行治療和預防的潛在能力。研究人員發(fā)現它可以改變神經元膜中的磷酸鹽類脂化合物結構，并且在引發(fā)神經組織衰退綜合癥的相關因素中發(fā)現它具有緩解身體緊張性的奇特功效。
甘油磷酸膽堿的理化結構以及相互聯(lián)系的理化特性，確保了它成為非常對腦組織有益的、能時刻保護腦組織新陳代謝的磷脂類物質。乙酰膽堿可幫助腦部完成記憶、學習等活動。在體內，甘油磷酸膽堿可穿過血腦屏障，這種生理生化特性為乙酰膽堿的生物合成提供了必要的原料—膽堿。“ 膽堿能損傷假說”，認為膽堿能的活性喪失與阿爾茨海默氏癥的嚴重程度有關。
六、用途
甘油磷酸膽堿已經在意大利、波蘭、希臘、智利、韓國、巴西、俄羅斯等國家上市。它不僅能夠提供腦細胞和神經細胞所需要的高水平膽堿，而且還能保護其細胞壁。阿爾茲海默癥患者主要表現為記憶力與認知功能下降，并且伴有多種并發(fā)癥，如行動不便、神經系統(tǒng)紊亂等功能性障礙。臨床的藥理學試驗結果和臨床試驗都已證實甘油磷酸膽堿對大腦的認知能力和記憶功能大有幫助。
甘油磷酸膽堿可以延緩記憶力的衰退，對于腦部中風、顱與腦部損傷患者的康復與預防。由于年齡的增長而致使人腦的細胞膜受損，當體內乙酰膽堿和磷脂酰膽堿的合成數量增加了，情況就會得到改善。甘油磷酸膽堿能夠進入脂蛋白結構中，它不僅可以口服還可以靜脈注射。醫(yī)藥動力學研究證明，甘油磷酸膽堿能在靜脈注射和小腸的位置被吸收，再經過血液循環(huán)進入到各個器官之中，并在肝臟中結合脂蛋白。它在青少年身體成長、保護肝臟、抗類風濕、改善老年人的認知能力、抗動脈硬化、抵抗高脂蛋白食物的脂肪滲透、提高記憶力等方面也具有一定的作用。
七、制備方法
目前，國內外關于gpc 的制備方法有動物器官直接萃取法、化學合成法、化學水解法、磷脂酶水解法。
1）動物器官直接萃取法
為了得到gpc，用了從牛胰臟中提取的方法。將牛胰臟破碎，取0.5 g 牛胰臟組織液，加入2 ml 純凈水，得到組織懸浮液，再加入40 ml 氫氧化鈉溶液( 0.1 mol /l)，轉移至錐形瓶中，加入無水乙醇與( 體積比3∶ 1) 進行萃取，分離層，得到無水乙醇萃取物，煮沸后，過濾。濾液加入石油醚進行二次萃取，分離，將無水乙醇中的萃取物抽濾，烘干，得到gpc 粗品。該方法操作工藝復雜，且產品收率低，已被其他方法所代替。
2）化學合成法
應用環(huán)氧開環(huán)反應原理，提出用( ｒ)-( + ) 縮合甘油( ( ｒ)-( + ) glycidol) 與磷酸膽堿在異丙胺存在下進行親核加成，再經過離子交換樹脂層析制備gpc，該工藝方法簡潔，但總收率低于50%，鑒于縮水甘油( 2，3-環(huán)氧-1-丙醇) 不穩(wěn)定需冷凍保存以避免自身縮合，使用前必須測定其純度，通常還要減壓蒸餾純化。將2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷雜環(huán)戊烷在0 ～ 10℃下在惰性溶劑中與異亞丙基甘油縮合；得到的縮合物與三乙胺在室溫下開環(huán)縮合，得到gpc 粗品； 再經陽離子交換樹脂濃縮，然后結晶，得gpc。
3）化學水解法
采用醇解蛋黃磷脂制備gpc，旋蒸除去溶劑，再用進行萃取，得到gpc 與甘油磷酰乙醇胺的混合物，然后用硅膠柱進行純化，得到精制gpc。以四丁基氫氧化銨為催化劑水解卵磷脂，得到較純的gpc，但是需要除去催化劑，對產品進行重結晶純化，整個過程較復雜，成本較高。利用卵磷脂水解法制備gpc，利用沉淀副產物以達到純化gpc 的目的，過量的汞離子通過硫化氫和碳酸鋇除去，這種方法效率較低，得到的gpc 不僅含有未反應的卵磷脂，還殘留了大量有毒的汞離子。
采用將蛋黃卵磷脂溶于中，在室溫下攪拌2 h，生成的沉淀用洗滌后，溶解在甲醇中，加入硅藻土，制成gpc 硅藻土混合粉末，將該粉末與4-二甲基氨基吡啶混合，加入氯仿，在冰水浴中冷卻，50℃超聲破碎48 h，過濾除去硅藻土，上清液濃縮后經過硅膠柱，得到的有效成分用hodamine 6g 和dittmerlester-reagent 噴射顯色后，濃縮，上葡聚糖凝膠柱純化，得高純度的gpc。
4）磷脂酶水解法
采用酶水解法制備gpc，屬于脂質開發(fā)應用技術領域。其采用在水相體系中以磷脂酶a1 水解大豆粉末磷脂制備gpc，gpc 得率達到95%。用lipozyme im 和磷脂酶a2 在微乳體系中共同催化水解磷脂酰膽堿48 h 制備gpc，其產率達94%，此法用雙酶催化，成本較高，且反應時間很長；利用磷脂酶a1 催化pc80水解，24 h 后產物gpc 產率為86%。采用吸附法制備固定化磷脂酶a1 催化磷脂酰膽堿制備gpc，該方法gpc 產率可達85%，此法提高了磷脂酶a1 的貯存穩(wěn)定性，簡化了分離純化過程，且實現了酶的多次重復利用。