rna-seq即轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，就是把mrna，smallrna，and noncoding rna等或者其中一些用高通量測(cè)序技術(shù)把它們的序列測(cè)出來。反映出它們的表達(dá)水平。
rna-seq是一種集合實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算機(jī)手段的一種技術(shù)，它可以確定生物樣本中rna序列的特征性和豐度，也就是說，存在于每條單鏈rna分子中的腺嘌呤、胞嘧啶、*和*核糖核酸殘基的組成順序，可以通過rna測(cè)序被識(shí)別出來。rna-seq中的實(shí)驗(yàn)方法涉及從細(xì)胞、組織或整個(gè)動(dòng)物樣本中分離rna、不同rna文庫的構(gòu)建、對(duì)文庫進(jìn)行化學(xué)法測(cè)序以及隨后的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析。同早期的技術(shù)方法相比，例如微陣列，一+個(gè)關(guān)鍵區(qū)別在于，當(dāng)前rna-seq平臺(tái)驚人的高通量性和高的靈敏度，使得我們能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、基因調(diào)控模型和更多非編碼小rna。
轉(zhuǎn)錄組是某個(gè)物種或者特定細(xì)胞類型產(chǎn)生的所有轉(zhuǎn)錄本的集合。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。基于illumina高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)使能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時(shí)，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)以及csnp（編碼序列單核苷酸多態(tài)性），提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息。相對(duì)于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無需預(yù)先針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，即可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，提供更的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具。
樣品提取總rna后，對(duì)于真核生物，用帶有oligo(dt)的磁珠富集mrna，對(duì)于原核生物，用試劑盒去除rrna，向得到的mrna中加入fragmentation buffer使其片斷成為短片段，再以片斷后的mrna為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成cdna鏈，并加入緩沖液、dntps、rnase h 和dna polymerase i 合成cdna第二鏈，經(jīng)過試劑盒純化并加 eb緩沖液洗脫經(jīng)末端修復(fù)、加堿基a，加測(cè)序接頭，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，并進(jìn)行pcr擴(kuò)增，從而完成整個(gè)文庫制備工作，構(gòu)建好的文庫用illumina hiseq2000進(jìn)行測(cè)序。
rna測(cè)序流程包括：
樣本制備、建庫：總rna ---> polya富集mrna ---> 打斷 ---> 隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cdna ---> 末端修復(fù)、加a、加接頭
一、rna樣本采集保存
1、血液rna保存
paxgene® blood rna tube*用于采血時(shí)細(xì)胞內(nèi)rna的快速穩(wěn)定。內(nèi)含保護(hù)劑采集后可以快速穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)rna。室溫穩(wěn)定3天，4℃穩(wěn)定5天。
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bd
762165
paxgene® blood rna tube
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rnagard blood tubes*用于血液rna和dna的采集、保存和純化。管內(nèi)預(yù)裝保護(hù)劑能快速滲透細(xì)胞膜裂解細(xì)胞，同時(shí)穩(wěn)定rna和dna免于降解。室溫能保存核酸達(dá)14天，4℃能保存1月。
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biomatrica 12006-051 rnagard blood tubes&precipitation buffer 50支 / 包 +180 ml
血漿游離rna保存
cell-free rna bct® *用于血漿游離rna的采集、保存和運(yùn)送。含有保護(hù)劑穩(wěn)定血漿游離rna，并能防止血液中其他背景rna的釋放。室溫下游離rna能穩(wěn)定7天
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streck
218976
cell-free rna bct®
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2、組織rna保存
rnalater穩(wěn)定液是一種無毒的水溶性組織保存試劑，能夠快速滲入組織內(nèi)部，穩(wěn)定并保護(hù)細(xì)胞rna。在37°c、25°c和4°c下 rna 分別可保持穩(wěn)定1天、1周和1個(gè)月，-20°c下可*穩(wěn)定保存。
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thermo am7020 rnalater™ stabilization solution 100 ml
thermo am7021 rnalater™ stabilization solution 500 ml
bi 01-891-1b rna save 100ml
bi 01-891-1a rna save 500 ml
二、rna提取方法-使用試劑盒方法
富集mrna，除去rrna等rna:依據(jù)為-在測(cè)mrna過程中，首先要去除rrna。以人為例，在抽提的總rna中，95%的rna是rrna，2%的rna是mrna，剩下的則是lncrna、microrna、sirna等。rrna整個(gè)人類當(dāng)中是非常保守的，在各個(gè)組織器官中也是非常穩(wěn)定的，因此這些測(cè)序結(jié)果對(duì)我們的研究是沒有用處的。mrna則是rna中比較重要的部分。
具體：以人的為例：總rna跟帶有poly(t)探針的磁珠結(jié)合-洗脫結(jié)合的mrna-用mg離子溶液打碎mrna-隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)條鏈的cdna，之后再合成第二條cdna,獲得雙鏈cdna-對(duì)雙鏈cdna末端修復(fù)，加a加接頭-片段選擇，pcr擴(kuò)增、純化（如果樣本中存在污染物，則需要結(jié)合試劑盒進(jìn)一步純化）。
一般會(huì)在測(cè)序前對(duì)總rna進(jìn)行一次質(zhì)檢，根據(jù)電泳質(zhì)檢結(jié)果中的18s和28s（rrna）兩個(gè)峰的高度以及峰的尖度來判斷rna的質(zhì)量，峰越高越尖（rin > 8.0）表示rna的完整度越好。當(dāng)然，濃度以及a260/a280比值也是需要的。
總rna提取
trizol™ reagent是一種*的即用型試劑，可用于提取高質(zhì)量的總rna或者從各種生物樣本中同時(shí)提取rna、dna和蛋白質(zhì)。這種酚和異硫氰酸胍單相溶液，可用于提取人、動(dòng)物、植物、酵母或細(xì)菌來源的細(xì)胞和組織樣本中的純r(jià)na、dna和蛋白質(zhì)，只需一個(gè)小時(shí)即可完成。
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thermo
15596018
trizol™ reagent
200 ml
thermo
15596026
trizol™ reagent
100
genezol™ reagent試劑用于高質(zhì)量總rna的提取，同時(shí)也可提取血液、白膜層、血漿、血清、培養(yǎng)細(xì)胞和組織等多種樣本中rna、dna和蛋白質(zhì)。genezol是一種酚、三氯甲烷和異硫氰酸胍溶液，是總rna提取經(jīng)濟(jì)有效的選擇。所提取rna可直接用于各種下游應(yīng)用，如cdna 文庫構(gòu)建，克隆，逆轉(zhuǎn)錄pcr，實(shí)時(shí)pcr，核酸酶保護(hù)分析和northern印跡雜交。
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geneaid gzr050/100/200 genezol reagent 50, 100, 200次反應(yīng)
geneaid gzx050/100/200, gzxd050/100/200 genezol trirna pure kit 50, 100, 200次反應(yīng)
rneasy mini kit 試劑盒可從細(xì)胞、組織或酵母中快速純化高品質(zhì)rna，硅膠膜rneasy離心柱的結(jié)合能力達(dá)100 μg rna。無需酚/三氯甲烷抽提，無需氯化銫梯度離心，無氯化鋰或者乙醇沉淀步驟。數(shù)分鐘內(nèi)快速純化得到高品質(zhì)總rna，在各種下游應(yīng)用中表現(xiàn)良好。
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qiagen 74104 rneasy mini kit 50次
qiagen 74106 rneasy mini kit 250次
qiagen 74134 rneasy plus mini kits 50次
單細(xì)胞rna提取
arcturus picopure rna 分離試劑盒用于從十個(gè)以下細(xì)胞甚至單細(xì)胞中回收高質(zhì)量總rna。
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thermo/abi
kit0204
arcturus picopure™ rna isolation kit
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thermo/abi
kit0214
arcturus picopure™ rna isolation kit
200 樣本
去dna
ambion turbo dna-free kit 除dna試劑盒能夠*地消化dna，并去除消化后的酶和二價(jià)陽離子。
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thermo/invitrogen am1907 turbo dna-free™ kit 50 reactions
去rrna
ribo-zero rrna removal kit(human/mouse/rat)試劑用于從人、小鼠、大鼠樣本中去除細(xì)胞質(zhì)核糖體rna。
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illumina/epicentre mrzh116 ribo-zero rrna removal kit (human/mouse/rat) 6反應(yīng)
illumina/epicentre mrzh11124 ribo-zero rrna removal kit (human/mouse/rat) 24反應(yīng)
ribominus eukaryote kit 除核糖體rna
細(xì)菌mrna提取
microbexpress™ kit細(xì)菌mrna富集試劑盒通過從總rna除去rrna來提取細(xì)菌mrna。
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thermo/invitrogen am1905 microbexpress™ bacterial mrna enrichment kit 20 次
pcr產(chǎn)物純化
dna clean & concentrator™-5試劑盒用于純化高達(dá)5μg dna，dna可來自pcr，核酸內(nèi)切酶消化、dna修飾、同位素/熒光標(biāo)記等生化反應(yīng)。洗脫dna適用于pcr、微陣列、連接和測(cè)序等。該產(chǎn)品有助于去除dna聚合酶、修飾酶、rna聚合酶、連接酶、激酶、核酸酶、磷酸酶和限制性內(nèi)切核酸酶，以及游離dntp及其類似物，包括放射性標(biāo)記和熒光衍生物。
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zymo d4013 / d4014 dna clean & concentrator™-5，封端柱子 50/200次
zymo d4003/d4004/d4003t dna clean & concentrator™-5，無封端柱子 50/200/10
磁珠純化
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beckman a63987 rnaclean-xp
vdobiotech ms04t oligo（dt）磁珠
vdobiotech cngs-0005 cleanna
vdobiotech ms02h/mys300h/ma300h 核酸提取磁珠
細(xì)胞核分離
nuclei ez prep細(xì)胞核分離試劑盒用于從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中快速分離胞核。該試劑盒可從通用細(xì)胞類型獲得高得率細(xì)胞核。適合為染色質(zhì)、基因組dna、組蛋白和核rna/rnp提供細(xì)胞核來源，為體外凋亡檢測(cè)、功能性研究（如細(xì)胞轉(zhuǎn)錄狀態(tài)檢查）制備細(xì)胞核。
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sigma nuc101 nuclei ez prep 1 kit
三、文庫構(gòu)建
建庫：去除rrna之后獲得的mrna進(jìn)行構(gòu)建文庫，先對(duì)mrna打斷再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的文庫構(gòu)建方法。之后反轉(zhuǎn)的cdna再末端修復(fù)到平末端，加上ploya和接頭
品牌 貨號(hào) 名稱
kc dr085-01/02 kc-digital stranded mrna-seq library prep kit for illumina®
kc dlr087-01/02 kc-digital total rna-seq library prep kit for illumina®
kc nr084-01/02 kc stranded mrna-seqlibrary prep kit for illumina®
kc nr086-01/02 kc total mrna-seqlibrary prep kit for illumina
rubicon r500653 smarter® microrna-seq kit
四、測(cè)序試劑盒
測(cè)序：se測(cè)序-單端測(cè)序；pe測(cè)序-雙端測(cè)序；一般現(xiàn)在用的是pe測(cè)序。
uid轉(zhuǎn)錄組建庫試劑盒
省時(shí)同時(shí)構(gòu)建8個(gè)文庫僅5小時(shí)，時(shí)間節(jié)省30％省力無需第二鏈合成等步聚，操作簡便省心建庫起始量低至100ng測(cè)序結(jié)果與qpcr結(jié)果高度一致品牌 貨號(hào) 產(chǎn)品描述 包裝
kc dro85－01/dro85－02 kc-digitaltmstrandedmrna-seqlibraryprepkitfor illumina® 24次/96次
kc dlro87－01/dlro87－02 kc-digitaltmtotalrna-seqlibraryprepkitforillumina® 24次/96次
rna鏈特異性建庫試劑盒
省時(shí)同時(shí)構(gòu)建8個(gè)文庫僅5小時(shí)，時(shí)間節(jié)省30％省力無需第二鏈合成等步聚，操作簡便省心建庫起始量低至100ng品牌 貨號(hào) 產(chǎn)品描述 包裝
kc nr084-01/ nr084-02 kctmstranded mrna-seqlibrary prep kit for illumina® 24次/96次
kc nlr086-01/nlr086-02 kctm total rna-seqlibrary prep kit forillumina® 24次/96次
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紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 ：1500 1904 520 q:239 555 7778
紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司主營：干細(xì)胞、醫(yī)療、細(xì)胞治療、器官再生 四大板塊的產(chǎn)品，以傳遞科學(xué)價(jià)值，服務(wù)科學(xué)研究”為宗旨，經(jīng)過近兩年的努力推廣，紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司在全中國代理的cellartis干細(xì)胞產(chǎn)品已經(jīng)成功銷往：上海市、北京市、重慶市、天津市、廣東省的廣州市、深圳市、珠海市、江西省的南昌市、四川省的成都市、綿陽、浙江省的杭州市、寧波、溫州、江蘇省的南京市、蘇州、無錫、泰州、湖南省的長沙、陜西省的西安市、楊凌、甘肅省的蘭州、寧夏的銀川、新疆的烏魯木齊、廣西省的南寧市、山東省的濟(jì)南、青島、東北三省 遼寧省的沈陽市、大連市、吉林省的長春市、黑龍江省的哈爾濱市等中國絕大部分省市和自治區(qū)。