漲知識 | 克隆專題二：不同分子克隆方法介紹（下）
克隆是英文“clone”或“cloning”的音譯，而英文“clone”則起源于希臘文“klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插條。1963年j.b.s.haldane在題為“人類種族在未來二萬年的生物可能性”的演講上采用“克隆（clone）”的術(shù)語，把“克隆技術(shù)”帶到了人們的視野中。
克隆技術(shù)又稱為“生物放大技術(shù)”，目前應(yīng)用泛的技術(shù)為“分子克隆”，又稱重組dna技術(shù)，即通過重組技術(shù)將目的dna片段按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時(shí)復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生新的遺傳性狀的技術(shù)。
之前小翌給小伙伴們介紹了常規(guī)的分子克隆方法，接下來繼續(xù)帶領(lǐng)大家認(rèn)識一下新的、非常規(guī)的分子克隆技術(shù)，包括無縫克隆中的golden gate技術(shù)、gateway技術(shù)、不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法等等。
01golden gate技術(shù)golden gate克隆在2008年由engler等人提出，是依賴iis型限制酶的無縫克隆技術(shù)，能媲美gibson assembly，主要用于多片段克隆組裝。實(shí)驗(yàn)步驟與傳統(tǒng)克隆技術(shù)相似，但限制性內(nèi)切酶酶切原理不同。傳統(tǒng)酶切使用的typeii型限制性內(nèi)切酶通常識別4-8 bp的回文序列，并在識別序列內(nèi)部切割產(chǎn)生粘性末端或平末端。golden gate克隆技術(shù)通過typeiis型限制性內(nèi)切酶（翌圣bsmbi cat#15203es、bspqi限制性內(nèi)切酶cat#15202es、funicut™bsaicat#15005es）識別目的序列以外的四個(gè)堿基，剪切后獲得粘性末端，直接用于目的片段的連接。通過連接酶（翌圣t4 dna連接酶cat#10300）連接形成重組質(zhì)粒，使用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，由于限制性內(nèi)切酶的特性，酶切連接后酶切位點(diǎn)不再存在，能達(dá)到精確的無縫克隆。engler等人利用該技術(shù)成功連接了9個(gè)目的片段，連接率達(dá)90%以上。
圖1. golden gate assembly克隆原理示意圖【1】
02gateway技術(shù)gateway技術(shù)最早在1990s年被發(fā)現(xiàn)應(yīng)用，主要用于表達(dá)載體、rnai干擾載體等載體的構(gòu)建。其原理利用噬菌體的特性：即噬菌體dna會(huì)定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上。科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體和細(xì)菌內(nèi)均含有重組位點(diǎn)attp和attb，能有效幫助噬菌體入侵宿主細(xì)胞，從而將噬菌體dna插入到細(xì)菌基因組上，同時(shí)在重組位點(diǎn)上產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attl和attr，該過程可逆。
gateway構(gòu)建表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)流程如下圖：
圖2. gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體【2】
此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于利用位點(diǎn)特異重組成入門載體后，不再受到酶切位點(diǎn)和連接酶的限制，可以多次轉(zhuǎn)移到其他載體上。再加上供體載體含有ccdb致死基因，會(huì)殺死重組不成功的質(zhì)粒，所以陽性克隆率高，但受控于存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。此外，需要注意的一點(diǎn)是，進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)需要使用對ccdb敏感的大腸桿菌菌株，如翌圣dh5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（cat#11802es）、翌圣化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（cat#11801es），能抑制大腸桿菌菌株的生長繁殖，進(jìn)行負(fù)篩。
03不依賴基因序列和連接反應(yīng)的克隆方法（slic）2007年，來自于哈佛醫(yī)學(xué)院的li等人建立了不依賴序列和連接的克隆方法（sequence and ligation-independent cloning，slic）。slic方法不受目的序列和連接反應(yīng)的限制，能將任意、多個(gè)dna片段組裝起來，在體外完成重組反應(yīng)，用途非常廣泛。
基本操作流程如下：
01pcr擴(kuò)增目的片段，在片段兩端分別加上15-30 bp的同源序列；02利用t4 dna聚合酶的3'-5'外切酶活性，在22℃條件下消化dna片段，產(chǎn)生含有同源序列的5'-ssdna突出端。突出端長度可通過dctp控制；03將處理后的目的片段置于t4 dna連接緩沖液中，于37℃完成突出單鏈的復(fù)性重組，形成含有缺口的環(huán)狀中間體，直接轉(zhuǎn)化細(xì)胞；04利用大腸桿菌自身的修復(fù)系統(tǒng)使其形成完整的環(huán)狀質(zhì)粒。
圖3.slic法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟【3】
04細(xì)胞裂解物體外無痕連接細(xì)胞裂解物體外無痕連接（slice）是利用細(xì)胞裂解物而進(jìn)行體外無痕組裝dna的方法，能一步組裝多個(gè)目的片段。它在2012年由zhang等人提出，在2013年由fisher等人進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，擴(kuò)增了可用于該技術(shù)的細(xì)胞裂解物，此外，itaya等人發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌本身就具有可用于片段組裝的同源重組系統(tǒng)，進(jìn)一步擴(kuò)展了可用的細(xì)胞裂解物來源。相比于其他不依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶的技術(shù)，slice方法使用的細(xì)胞裂解物更易獲得和保存，實(shí)驗(yàn)成本更低，適用于大多數(shù)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。其具體的操作步驟是，利用pcr技術(shù)在目的片段兩側(cè)分別加上20-25 bp的同源序列，用dpni酶（翌圣funicut™ dpni cat#15052es）消化處理，組裝片段按合適的比例混勻，加入大腸桿菌細(xì)胞裂解物，37℃反應(yīng)1 h，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，即可實(shí)現(xiàn)體外無痕組裝dna。
圖4.slice技術(shù)【4】
通過上述兩篇專題，小翌介紹了一些傳統(tǒng)的、應(yīng)用范圍廣的、新型的分子克隆方法，希望對各位科研er們的日常實(shí)驗(yàn)有所幫助和啟發(fā)。隨著近幾年基因編輯技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子克隆技術(shù)越來越趨于高效化、多樣化，其中的每一項(xiàng)內(nèi)容都值得我們?nèi)ヌ骄?。關(guān)注我們，小翌會(huì)在下一期的分子克隆技術(shù)專題中給大家具體講解分子克隆技術(shù)中應(yīng)用到那些技術(shù)，為您的實(shí)驗(yàn)帶來新的思路與方向，期待下一次的見面~
05相關(guān)產(chǎn)品列表
產(chǎn)品定位
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號
規(guī)格
golden gate組裝
bspqi限制性內(nèi)切酶 (10 u/μl)
15202es76
500 u
golden gate組裝
bsmbi（10 u/μl）
15203es80
1000 u
通用緩沖液，5min完成精準(zhǔn)酶切
funicut™快速限制性內(nèi)切酶
15001es-15051es
50 t
t4連接
hieff® gold t4 dna ligase
10300es80
1000 u
5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化
f dh5α化學(xué)感受態(tài)
11803es80
10×100 μl
常規(guī)化學(xué)感受態(tài)
dh5α 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞
11802es80
10×100 μl
常規(guī)化學(xué)感受態(tài)
化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞
11801es80
10×100 μl
常規(guī)pcr
2×hieff®pcr master mix(with dye)
10102es03/08
1 ml/5×1 ml
常規(guī)pcr，不含染料
2×hieff®pcr master mix(no dye)
10103es03/08
1 ml/5×1 ml
快速pcr，快至1s/kb
2×hieff®ultra-rapid hotstart pcr master mix(with dye)
10157es03/08
1 ml/5×1 ml
06參考文獻(xiàn)1.engler c,gruetzner r,kandzia r,et al.golden gate shuffling:a one-pot dna shuffling method based on type iis restriction enzymes.plos one,2009,4(5):e5553.2.林春晶,韋正乙,蔡勤安等.幾種植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[j].生物技術(shù),2008(05):84-87.3.張陽璞,楊淑慎.幾種新型植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法[j].生物工程學(xué)報(bào),2015,31(03):311-327.4.楊發(fā)譽(yù),楊云彭,霍毅欣.合成生物學(xué)中不依賴限制性內(nèi)切酶的分子克隆策略[j].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2018,34(04):364-370.