使用 dnastorm™ 試劑盒獲得的 dna 中是否存在污染 rna？通過(guò)在裂解步驟后立即執(zhí)行優(yōu)化的 rnase 消化步驟來(lái)消除 rna 污染。
我預(yù)計(jì)可以從 ffpe 樣本中獲得多少 dna？影響獲得的 dna 總量的最大變量是樣本本身的質(zhì)量（即組織的類型和數(shù)量，以及樣本分離和保存的注意事項(xiàng)）。使用 dnastorm™ 試劑盒，并假設(shè)樣品質(zhì)量至少合理，可以獲得大于 1 µg 的量。
使用 dnastorm™ 試劑盒獲得的 dna 可以用于下一代測(cè)序嗎？是的。只要 dna 的質(zhì)量足夠高，就可以獲得高質(zhì)量的文庫(kù)。
組織應(yīng)該如何準(zhǔn)備？使用切片機(jī)從 ffpe 樣品中獲取 5-10 µm 的切片。如果可以可靠地切割，可以使用小于 5 µm 的切片。不建議使用厚度超過(guò) 10 µm 的切片，因?yàn)樗鼈兛赡軣o(wú)法全消化。
我可以使用非石蠟包埋的組織嗎？是的，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下，我們建議機(jī)械研磨相當(dāng)于推薦切片數(shù)量的組織。
我可以使用 ffpe 芯嗎？是的，可以使用 ffpe 芯材。由于核心不使用切片機(jī)進(jìn)行處理，因此樣品消化往往更加困難，如果觀察到消化不全，建議使用機(jī)械均質(zhì)化（例如使用鋼珠）。
您推薦哪種脫蠟方法？dnastorm™ 試劑盒包含推薦的脫蠟試劑。與其他常見(jiàn)方法（例如二甲苯）不同，脫蠟試劑高效、無(wú)毒，并且不需要使用通風(fēng)柜。在我們的測(cè)試中，所包含的試劑在去除石蠟和純化高質(zhì)量核酸方面至少與二甲苯一樣有效。
將脫蠟試劑與 cat5 裂解緩沖液混合后，我看到脫蠟試劑層和水層之間有白色混濁層。這是什么以及它如何影響提??？白色混濁層是脫蠟試劑和 cat5 裂解緩沖液之間的乳液，當(dāng)這兩種試劑渦旋或硬混時(shí)可能會(huì)形成。為避免此問(wèn)題，我們建議在脫蠟試劑和 cat5 裂解緩沖液接觸時(shí)不要渦旋樣品。當(dāng)需要在這兩種試劑存在的情況下混合時(shí)（例如添加蛋白酶時(shí)），我們建議使用移液器混合。通過(guò)以最大速度 (> 16,000 xg) 強(qiáng)力旋轉(zhuǎn)樣品至少 2 分鐘，可以去除白色渾濁層。時(shí)間長(zhǎng)短取決于乳液的體積。
如何評(píng)估我獲得的 dna 的完整性？由于從 ffpe 組織樣品中分離出的 dna 尺寸分布廣泛，我們建議使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pfge)。也可以使用基于毛細(xì)管電泳的方法，例如安捷倫生物分析儀，但可能無(wú)法正確解析質(zhì)量較好的樣品中的高分子量片段（大于 10k）。
為什么我提取的 dna 無(wú)法正常擴(kuò)增？我注意到很多 pcr 抑制和/或 ct 值毫無(wú)意義。當(dāng)使用大量 ffpe 提取的模板 dna 時(shí)，經(jīng)常會(huì)觀察到 pcr 抑制。這種抑制通常不是由于污染物的存在，而是由于 dna 本身的殘留化學(xué)修飾和損傷造成的。對(duì) pcr 方案進(jìn)行一些簡(jiǎn)單的調(diào)整就可以解決這個(gè)問(wèn)題。首先，應(yīng)減少模板dna的量。其次，pcr 聚合酶的量應(yīng)增加 2-4 倍。第三，應(yīng)延長(zhǎng)退火和延伸時(shí)間。第四，可以增加dntp的量。