流式實驗應用中，除了常見的表面抗原染色，還會進行胞內(nèi)因子檢測，比如：常見的細胞因子：ifn、il-2、il-4、il-6、il-10、tnf；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子：foxp3、gata3、stat5；胞內(nèi)信號通路相關蛋白：mapk家族 (akt、p38、jnk、erk) 等。胞內(nèi)染色步驟相對復雜，涉及的變異因素多，很容易出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定、較難重復等問題。
一般情況下，靜息狀態(tài)的t、b細胞不產(chǎn)生或極低產(chǎn)生細胞因子，多數(shù)細胞因子必須在t細胞激活后才能分泌產(chǎn)生，所以必須采用體外激活來刺激細胞因子的表達。流式胞內(nèi)染色中*常用的活化方法就是使用一定濃度的廣泛性刺激劑：pma (佛波酯) 和lonomycin (離子霉素)，刺激細胞4-6 h (可優(yōu)化)。
pma和lonomycin刺激細胞活化的機制：在細胞內(nèi)，protein kinase c(pkc) 的激活，可以引起下游眾多蛋白激酶的磷酸化，形成級聯(lián)反應，導致多種蛋白的表達引起細胞的活化。pkc可以在dag (二酯酰甘油) 和calcium (ca2+) 的共同作用下被激活，pma是一種dag的模擬物，lonomycin 是ca2+的轉(zhuǎn)運劑，可將細胞器內(nèi)的ca2+ 轉(zhuǎn)運到胞漿，所以pma和lonomycin的共同作用可以激活pkc，從而引起一系列的下游反應。
刺激后的細胞不能直接進行流式檢測，細胞因子會分泌到胞外影響實驗結(jié)果，還需要加入阻斷劑，將細胞因子阻斷在胞內(nèi)，有助于細胞因子的聚集使胞內(nèi)染色信號增強，提高檢出率，所以這一步至關重要。常用的阻斷劑有兩種：1. monensin (莫能霉素)；2. brefeldin a (bfa，布雷非德菌素a)。
monensin是一種離子載體(ionophore)，可選擇性結(jié)合單價陽離子如：li+、na+、k+、rb+、ag+和tl+，并把這些陽離子轉(zhuǎn)運到細胞膜內(nèi)，破壞跨膜離子梯度；bfa是一種真菌代謝物，可以干擾囊泡自粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運。這兩種阻斷劑的區(qū)別：monensin的阻斷作用在高爾基體轉(zhuǎn)運到胞外，bfa的阻斷作用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體。