化膿放線菌pcr定量試劑盒組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊(96孔)
2、 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 u/l，然后做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)，分別配制成200 u/l，100 u/l，50 u/l，25 u/l，12.5 u/l，6.25 u/l，3.12 u/l，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 u/l。如配制100 u/l標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml (不要少于0.3ml )200 u/l的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液a：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液b：1×10ml。
應(yīng)五要素：
衣氏放線菌pcr檢測(cè)試劑盒參加pcr反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dntp、模板和mg2+
引物：引物是pcr特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，pcr 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板dna互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板dna在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：
①引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。
③引物堿基：g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴(kuò)增效果不佳，g+c過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。atgc*隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致pcr失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。
引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。
注意事項(xiàng)：
5.1使用本試劑前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本說(shuō)明書(shū)全文。
5.2 操作時(shí)應(yīng)盡量少說(shuō)話，因口腔中也含有支原體，可能引起樣品污染，而造成假陽(yáng)性；整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，反應(yīng)體系的配制、樣本處理及加樣、pcr擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染。 5.3 實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑盒組分中的試劑使用前應(yīng)充分融化并混勻(混勻時(shí)禁止激烈振蕩，只需要進(jìn)行上下倒置多次進(jìn)行混勻)。
5.4 反應(yīng)管中加好所有的試劑后，應(yīng)盡快上pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增，以免形成過(guò)多的二聚體。
5.5細(xì)胞培養(yǎng)物中含有*和*等抗*不會(huì)影響本品的檢測(cè)結(jié)果。如果用戶需要進(jìn)一步提高檢測(cè)。