正畸牙齒移動(dòng)是通過(guò)施加機(jī)械力來(lái)實(shí)現(xiàn)的，然后是牙周組織重塑和再生。牙齒將力傳遞到牙周膜，牙周膜將力分布與牙槽骨，牙槽骨發(fā)生組織改建產(chǎn)生牙移動(dòng)。牙周膜干細(xì)胞（pdlscs）是介導(dǎo)正畸力轉(zhuǎn)導(dǎo)和牙周組織重塑的機(jī)械敏感細(xì)胞。進(jìn)一步研究pdlscs對(duì)正畸力的反應(yīng)并更好地了解這種機(jī)制對(duì)于改善正畸治療方法至關(guān)重要。
自噬是一種基本的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，介導(dǎo)細(xì)胞器降解和再循環(huán)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。先前的研究表明，自噬在專門(mén)的機(jī)械敏感細(xì)胞中起到機(jī)械適應(yīng)作用。它在髓核細(xì)胞中增加以響應(yīng)壓縮力刺激，但在足細(xì)胞中減少。然而，在正畸壓縮力的作用下，自噬在牙周膜中的作用仍然在很大程度上是未知的。研究初步發(fā)現(xiàn)，在生物力學(xué)負(fù)荷下，牙周膜成纖維細(xì)胞的自噬增加。然而，在牙齒移動(dòng)過(guò)程中，自噬在壓縮區(qū)域受到調(diào)節(jié)的確切機(jī)制尚不清楚。
長(zhǎng)鏈非編碼rnas（lncrnas）是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，成為自噬領(lǐng)域的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究表明，lncrnas通過(guò)調(diào)節(jié)自噬參與各種細(xì)胞途徑，包括缺血和再灌注損傷，腫瘤發(fā)生，心血管疾病和糖尿病等。fer-1樣家族成員4（fer1l4）是一種新發(fā)現(xiàn)的 lncrna，已被證明與某些類(lèi)型的癌癥有關(guān)，包括肺癌、肝細(xì)胞癌、骨肉瘤和子宮內(nèi)膜癌。然而，還沒(méi)有研究調(diào)查fer1l4在自噬中的功能和機(jī)制。
因此，北京大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科、口腔數(shù)字化醫(yī)療技術(shù)和材料國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室研究團(tuán)隊(duì)曾探討了pdlscs在壓縮力下的自噬活性，并進(jìn)一步確定lncrna fer1l4對(duì)pdlscs在機(jī)械應(yīng)力下的自噬是否重要，如果重要，潛在的機(jī)制是什么。
壓縮力作用下pdlscs中自噬被誘導(dǎo)
將牙周膜干細(xì)胞暴露于靜態(tài)壓縮力下（2 g/cm2）12小時(shí)（圖1 a）。cck-8測(cè)定顯示，有或沒(méi)有壓縮力組細(xì)胞增殖相似（圖1 b）。流式細(xì)胞術(shù)分析也證實(shí)，與對(duì)照組相比，壓縮力組的細(xì)胞凋亡和壞死無(wú)顯著差異（圖1 c）。進(jìn)一步測(cè)定自噬活性。自噬的兩種生物標(biāo)志物lc3 ii/i和beclin1的表達(dá)水平在壓縮力組中較高（圖1 d）。在熒光顯微鏡下自噬體以多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)存在。壓縮力組lc3呈點(diǎn)狀分布，在核周和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域周?chē)冀K顯著（圖1 e）。tem也用于檢測(cè)自噬流。自噬體定義為pdlscs細(xì)胞質(zhì)中含有細(xì)胞碎片或降解細(xì)胞器的雙膜囊泡，在壓縮力組中增加（圖1 f）。為了確定自噬的作用，用自噬抑制劑氯喹（10 μm）處理pdlscs。結(jié)果表明，抑制自噬流后凋亡細(xì)胞顯著增加（圖1 g）。當(dāng)用自噬抑制劑預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，輕度壓縮力（2 g/cm2）誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞凋亡（圖1 h）。
圖1 pdlscs在壓縮作用下的自噬增加。將細(xì)胞施加靜態(tài)壓縮力12小時(shí)。
lncrna fer1l4在受壓縮力作用的pdlscs中顯著上調(diào)
先前的rna測(cè)序原始數(shù)據(jù)顯示，在壓縮力作用下，pdlscs中的fer1l4顯著增加（約7倍）。為了進(jìn)一步研究fer1l4的作用，使用fish技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察fer1l4的分布。結(jié)果表明，fer1l4位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。靜態(tài)壓縮力刺激后，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中fer1l4的強(qiáng)度均增加。
fer1l4介導(dǎo)由壓縮力誘導(dǎo)的pdlscs的自噬
為了研究fer1l4在pdlscs自噬調(diào)節(jié)中的作用，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了功能獲得和功能喪失測(cè)定。pqll-fer1l4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組fer1l4表達(dá)顯著升高，sifer1l4轉(zhuǎn)染組fer1l4表達(dá)顯著降低（圖2 a）。
用pqll-fer1l4載體轉(zhuǎn)染后，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，自噬標(biāo)志物lc3 ii/i和beclin1的蛋白表達(dá)上調(diào)（圖2 b）。共聚焦顯微鏡下fer1l4過(guò)表達(dá)組lc3點(diǎn)狀的細(xì)胞質(zhì)形成顯著增加，表明自噬體形成顯著增加（圖2 c）。tem進(jìn)一步證實(shí)了自噬體和自噬溶酶體的形成。轉(zhuǎn)染fer1l4載體后，pdlscs細(xì)胞質(zhì)中的自噬體和自噬溶酶體數(shù)量增加（圖2 d）。
為了確定fer1l4是否介導(dǎo)pdlscs在壓縮力下的自噬，用sifer1l4預(yù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后暴露于機(jī)械應(yīng)力12小時(shí)，結(jié)果表明，通過(guò)敲低fer1l4，機(jī)械應(yīng)力誘導(dǎo)的lc3 ii/i和beclin1表達(dá)均被消除（圖2 e）。
圖2 fer1l4促進(jìn)pdlscs的自噬水平。
fer1l4在施加外部壓縮力期間通過(guò)akt/foxo3信號(hào)通路調(diào)節(jié)自噬
akt信號(hào)通路在自噬的負(fù)調(diào)控中很重要。為了研究fer1l4是否調(diào)節(jié)pdlscs中的akt信號(hào)通路，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果表明，fer1l4過(guò)表達(dá)抑制了akt（p-akt）的磷酸化，而akt總量幾乎保持不變（圖3 a）。伴隨p-akt的降低，觀察到p-foxo3的顯著降低和foxo3表達(dá)的增加（圖3 a）。免疫熒光測(cè)定也檢測(cè)了foxo3蛋白的定位。fer1l4過(guò)表達(dá)組foxo3免疫染色較強(qiáng)（圖3 b）。而在fer1l4敲低細(xì)胞中，akt的磷酸化和foxo3的磷酸化上調(diào)，foxo3的表達(dá)下調(diào)（圖3 c）。免疫染色也顯示 fer1l4 敲低組 foxo3 的熒光染色相對(duì)較弱（圖3 d）。
為了進(jìn)一步確定fer1l4是否通過(guò)akt/foxo3信號(hào)通路介導(dǎo)壓縮力下pdlscs的自噬，實(shí)驗(yàn)隨后研究了在施加壓縮力期間該通路的激活情況?；?kegg 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)先前rna測(cè)序數(shù)據(jù)的通路分析表明，機(jī)械應(yīng)力顯著影響pi3k/akt信號(hào)通路。一致地，暴露于壓縮力的pdlscs中p-akt和p-foxo3顯著降低，而foxo3的核易位增加。然而，當(dāng)細(xì)胞用sifer1l4預(yù)轉(zhuǎn)染時(shí)，敲低fer1l4后，壓縮力引起的p-akt和p-foxo3的抑制作用和foxo3的激活作用均消失。
圖3 fer1l4抑制akt的磷酸化，增加foxo3的核易位。
fer1l4和自噬標(biāo)志物在正畸牙壓縮牙周膜中的表達(dá)上調(diào)
為了確定fer1l4和自噬在牙周膜對(duì)正畸力的反應(yīng)中的功能，實(shí)驗(yàn)使用了小鼠正畸牙齒移動(dòng)模型。fish檢測(cè)顯示，fer1l4 rna的熒光染色強(qiáng)度在牙周膜的壓縮區(qū)顯著誘導(dǎo)，而對(duì)照組牙周膜的熒光強(qiáng)度較低。此外，還確定了正畸牙齒受壓力下牙周膜中的自噬。免疫組織化學(xué)染色顯示，在應(yīng)用正畸加壓的區(qū)域，自噬標(biāo)志物lc3的活性增加。
圖4 fer1l4通過(guò)akt/foxo3通路介導(dǎo)正畸壓縮力作用下牙周膜干細(xì)胞自噬的示意圖。
綜上所述，該研究表明，正畸壓縮力誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞自噬，lncrna fer1l4通過(guò)akt/foxo3通路介導(dǎo)壓縮力作用下自噬的激活（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明了lncrna在正畸牙齒移動(dòng)的牙周組織重塑過(guò)程中自噬調(diào)控的機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：huang y, liu h, guo r, han y, yang y, zhao y, zheng y, jia l, li w. long non-coding rna fer1l4 mediates the autophagy of periodontal ligament stem cells under orthodontic compressive force via akt/foxo3 pathway. front cell dev biol. 2021 feb 2;9:631181. doi: 10.3389/fcell.2021.631181. pmid: 33604341; pmcid: pmc7884613.
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