l該試劑盒用于體外定量檢測(cè)人 血清、血漿或其他相關(guān)生物液體中mt的濃度。
實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）。往預(yù)先包被有人褪黑素(mt)抗體的微孔中，依次加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、hrp標(biāo)記的抗原，中間經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，用底物tmb顯色，tmb在過(guò)氧化物酶(hrp)的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人褪黑素(mt)呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（od值），計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成：
名稱
96孔配置
48孔配置
備注
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板
pre-coated assay plate
8孔×12條
8孔×6條
無(wú)
標(biāo)準(zhǔn)品
standard
2支
1支
按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋
通用稀釋液
universal diluent
2x20ml
1x20ml
無(wú)
濃縮hrp-抗原h(huán)rp-antigen(100×)
60μl
30μl
按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋
20×洗滌液
wash buffer(20×)
2x10ml
1x10ml
按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋
底物（tmb）
tmb substrate
10ml
5ml
無(wú)
終止液
stop solution
6ml
3ml
無(wú)
封板膜
plate sealer
4張
4張
無(wú)
說(shuō)明書(shū)
instruction manual
1份
1份
無(wú)
預(yù)包被96孔酶標(biāo)板
pre-coated assay plate
8孔×12條
8孔×6條
無(wú)
試劑盒參數(shù)：
性能
靈敏度
3.4pg/ml
檢測(cè)范圍
7.8-500pg/ml
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%.
特異性
可檢測(cè)樣本中人的mt，且與其類似物無(wú)明顯交叉反應(yīng).
需自備的設(shè)備及試劑：
1. 450±10nm 濾光片酶標(biāo)儀
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul.
3. eppendorf 移液器.
4. 蒸餾水或去離子水.
5. 脫脂棉吸水紙.
6. 37℃恒溫箱.
8. 準(zhǔn)備若干個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋管.
樣本處理及要求：
1.試劑盒檢測(cè)范圍不等同于樣本中待測(cè)物的濃度范圍，建議實(shí)驗(yàn)前通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)估樣本中待測(cè)物的濃度并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣本的實(shí)際濃度情況。如果樣品中待測(cè)物濃度過(guò)高或過(guò)低，請(qǐng)對(duì)樣本做適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。
2.若所檢樣本不在說(shuō)明書(shū)所列樣本之中，建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測(cè)有效性。
3.血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4.血漿：用edta或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
5.組織勻漿：用預(yù)冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的pbs（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9ml的pbs，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測(cè)。
6.細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
7.其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。
8.樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。
9.樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：
1.請(qǐng)?zhí)?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2.標(biāo)準(zhǔn)品梯度工作液配制：加入1ml通用稀釋液至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為500pg/ml)，然后按照以下濃度：500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、 15.6pg/ml、7.8pg/ml、0pg/ml進(jìn)行稀釋。
倍比稀釋方法：取7支ep管，每管中加入500μl通用稀釋液,500pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作液中吸取500μl到第一支ep管中混勻配成250pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按此步驟往后依次吸取混勻。最后一管直接作為空白孔，不需要再?gòu)牡箶?shù)第二管中吸取液體，具體如下圖。
3.hrp-抗原工作液配制：使用前15分鐘將濃縮hrp-抗原于1000×g離心1分鐘，以通用稀釋液將100×濃縮hrp-抗原稀釋成1×工作濃度(例：10μl濃縮液+990μl通用稀釋液)，當(dāng)日使用。
4.1×洗滌液配制：取10ml20×洗滌液到190ml蒸餾水中（從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶，屬于正?，F(xiàn)象，可放置室溫，輕搖均勻，待結(jié)
5.晶溶解后再配置)。
操作步驟：
1.從室溫平衡10分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.加樣：分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照50μl每孔加入相應(yīng)孔中，空白孔加入50μl通用稀釋液，緊接著每孔加入50μl hrp-抗原工作液。蓋上封板膜后37℃溫育1小時(shí)。（建議：將待測(cè)樣本用通用稀釋液稀釋1倍后再加入酶標(biāo)板內(nèi)測(cè)試，從而減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)試結(jié)果的誤差影響，最后計(jì)算樣本濃度時(shí)需乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。所有的待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)中建議設(shè)立復(fù)孔）。
3.洗板：棄去液體，每孔加入300μl 1x洗滌液，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次（也可用洗板機(jī)洗板）。
4.加底物：每孔加入底物(tmb)90μl，蓋上封板膜，37℃避光溫育15分鐘。
5.加終止液：每孔加入終止液50μl，立即在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值。
結(jié)果判斷：
1.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均od值。以濃度為橫坐標(biāo)，od值為縱坐標(biāo)，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。
2.若樣品od值低于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
典型數(shù)據(jù)和參考曲線：
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
濃度（pg/ml)
500
250
125
62.5
31.2
15.6
7.8
0
od值
0.188
0.27
0.389
0.642
0.929
1.38
1.766
1.842
注意：本圖僅供參考，應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本含量。
試劑盒性能：
1.重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
2.回收率：在選取的健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的人mt，計(jì)算回收率
樣本類型
范圍
平均回收率
血清（n=8)
81-101
96
血漿(n=8)
92-105
101
樣本類型
范圍
平均回收率
3.線性稀釋：分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度人mt，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。
稀釋比例
回收率（%）
血清
血漿
1：2
范圍（%）
83-95
88-96
平均回收率（%）
91
93
1：4
范圍（%）
89-104
87-108
平均回收率（%）
93
98