聚合酶鏈反應(pcr)技術(shù)是在體外進行的由引物介導的酶促dna擴增反應。pcr 反應特異性優(yōu)化方法合集：
1. 引物的設計
引物最好在模板 cdna 的保守區(qū)設計，長度 15-30bp，gc 含量小于 60%，3’端不超過連續(xù)三個 g 或 c，堿基分布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設計完成之后，需進行 blast 檢測，如果與其他基因不具有互補性，則可以進行下一步實驗。
2. 降落 pcr
降落 pcr 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 pcr，最大的優(yōu)點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優(yōu)化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度，退火溫度過高會使 pcr 效率過低，過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優(yōu)化，但費時費力。降落 pcr 提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法。首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數(shù)量優(yōu)勢，因此會對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制，從而大幅提高 pcr 的特異性和效率。
3. 熱啟動擴增
采用熱啟動方法進行擴增，是除了設計最佳引物之外，提高 pcr 反應特異性方式。在一般的 pcr 反應中，試劑的配置需在冰上進行，且要將 pcr 儀預熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 dna 鏈存在，就會擴增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前抑制酶的活性，方法就是使用熱啟動 taq 酶（或熱啟動高保真聚合酶）去擴增，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心，當溫度上升到 95℃時恢復活性，指導擴增。
4. 巢式 pcr
采用巢式 pcr 進行擴增，在多輪擴增結(jié)果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通 pcr 不同的是，它采用兩對引物進行擴增，首先用第一對引物普通 pcr，然后將第一輪擴增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物（巢式引物）二次擴增。因此采用巢式 pcr 可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。合適的瓊脂糖凝膠的濃度。