α-半乳糖苷酶（α-gal）活性檢測試劑盒說明書
注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
貨號：100t/48s
產(chǎn)品內容：
提取液：液體 100ml×1 瓶，4℃保存。
微量法
試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 2.5ml 雙蒸水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。
試劑二：液體 4ml×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15ml×1 瓶，4℃保存。
標準液：液體 1ml×1 支，4℃保存，5μmol/ml 對硝基苯酚溶液。
產(chǎn)品說明：
α-gal (ec 3.2.1.22)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，能專一地催化α半乳糖苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-gal
對于植物種子的萌發(fā)至關重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的 d-半乳糖通過糖酵解途徑迅速轉化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來源，后期則主要參與細胞壁儲藏多糖水解。
α-gal 分解對-硝基苯-α-d-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速率來計算α-gal 活性。
試驗中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、粗酶液提取：
1、細菌或培養(yǎng)細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復30 次），15000g，4℃，離心 20 分鐘，取上清，置冰上待測。
2、組織的處理：稱取約 0.2g 組織，加入 1ml 提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心 20 分鐘， 取上清，置冰上待測。
3、標準液的處理：用蒸餾水將標準液稀釋至 200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml.
二、測定步驟：
1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定，（在 ep 管或 96 孔板中依次加入下列試劑）：
試劑名稱（μl）
測定管
對照管
標準管
試劑一
25
蒸餾水
25
試劑二
35
35
樣本
10
10
迅速混勻，放入 37℃保溫 30min
標準液
70
試劑三
130
130
130
充分混勻， 400nm 處測定吸光值 a，計算δa=a 測定-a 對照。每個測定管需設一個對照管。三、α-gal 活性計算：
根據(jù)標準管的吸光度（x，減去濃度為 0 的標準管 od 值）和濃度（y，nmol/ml）建立標準曲線，將△a 帶入標準曲線中，計算樣品生成的產(chǎn)物量（nmol/ml）。
1.按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-gal 活力(nmol/h /mg prot)=(y×v 反總)÷(v 樣×cpr)÷t=14×y÷cpr 需要另外測定，建議使用本公司 bca 蛋白質含量測定試劑盒。
2.按樣本鮮重計算：
單位的定義：每 g 組織每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-gal 活力(nmol/h /g 鮮重)＝(y×v 反總)÷(w×v 樣÷v 樣總)÷t=14×y ÷w
3.按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。
α-gal 活力(nmol/h /104 cell)= (y×v 反總)÷(500×v 樣÷v 樣總)÷t=0.028×y
cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；v 反總：反應體系總體積，0.07ml；v 樣：加入反應體系中樣本體積，0.01ml；v 樣總：加入提取液體積，1ml；w：樣本質量，g； 500：細胞或細菌總數(shù)， 500 萬；t：反應時間，0.5h。
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