研究亮點(diǎn)：
1 系統(tǒng)性方法揭示了gata4在人類心臟發(fā)育和功能中的作用
2 雜合子gata4錯(cuò)義突變損害心臟基因程序
3 gata4 g296s突變破壞了心臟增強(qiáng)子tbx5的基因組占用
4 pi3k信號(hào)通路是gata4基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵樞紐
研究背景
轉(zhuǎn)錄因子(tfs)之間的組合相互作用導(dǎo)致組織特異性基因表達(dá)，從而決定了細(xì)胞的特性并維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平。tfs通過(guò)招募其他tfs、輔激活因子或輔抑制因子來(lái)激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。超級(jí)增強(qiáng)子(ses)，被中介復(fù)合物和tfs密集占據(jù)的假定增強(qiáng)子簇，被認(rèn)為是發(fā)育和疾病中細(xì)胞同一性的調(diào)節(jié)因子。ses的失調(diào)可能導(dǎo)致人類胚胎發(fā)生發(fā)育障礙和產(chǎn)后疾病。發(fā)育畸形占人類出生率大于5%。其中，先天性心臟缺損所占比例maximum（0.8%），而且通常是由于發(fā)育性調(diào)節(jié)型心臟tfs單倍型不足而導(dǎo)致的。在tfs中雜合突變gata4和tbx5會(huì)導(dǎo)致家族性先天性心臟發(fā)育不全，二者表型重疊；當(dāng)過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因時(shí)，兩者免疫共定位。在零星的先天性心臟發(fā)育不全中，這兩個(gè)基因存在突變，且與心肌病相關(guān)。我們之前的研究表明，gata4在g296s位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致gata4和tbx5在體外的互作能力受損。攜帶復(fù)合雜合子gata4和tbx5突變的小鼠會(huì)發(fā)生房室間隔缺損，為gata4與tbx5二者之間的互作提供了遺傳學(xué)證據(jù)。
盡管gata4和tbx5對(duì)小鼠心臟發(fā)生至關(guān)重要，但它們?cè)谌祟愋募〖?xì)胞（cms）中共同調(diào)節(jié)的基因靶點(diǎn)或信號(hào)通路以及它們?nèi)绾握{(diào)節(jié)人類心臟間隔的形成尚不清楚。與gata4相互作用的tbx5或nkx2.5*缺失，表明這些tfs在小鼠心臟分化中相互依賴調(diào)節(jié)彼此的基因組占用。
研究結(jié)果
轉(zhuǎn)錄因子中高度保守殘基的突變可能會(huì)影響蛋白與蛋白或蛋白間的相互作用，導(dǎo)致基因網(wǎng)絡(luò)的失調(diào)和人類疾病。本研究使用患者源性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips)細(xì)胞來(lái)剖析gata4在人類心臟發(fā)育和功能中的調(diào)節(jié)機(jī)制。研究人員利用了來(lái)自于患者g296s突變的、通過(guò)crispr-cas9修正的(iwt) 以及正常人的野生型（wt）成纖維細(xì)胞以非整合游離載體方法重編程獲得三種ips，在圖案化水凝膠的作用下將ips培養(yǎng)分化為心肌細(xì)胞cms。在分化cms過(guò)程中，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，對(duì)心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的標(biāo)志性基因表達(dá)情況，鈣通量及顯微鏡下形態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)和分析。
研究發(fā)現(xiàn)，雜合的gata4 g296s突變損害了心臟基因程序和sonic hedgehog (shh)信號(hào)通路的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了可變命運(yùn)基因的表達(dá)，特別是內(nèi)皮細(xì)胞譜系和與心臟分隔相關(guān)的基因。在與心臟發(fā)育和肌肉收縮相關(guān)的基因se元件處，gata4依賴的tbx5的募集被中斷，而在參與內(nèi)皮分化的基因座染色質(zhì)關(guān)閉失敗。這項(xiàng)工作揭示了一個(gè)關(guān)鍵心臟tf的單一錯(cuò)義突變是如何通過(guò)劑量依賴性調(diào)節(jié)tf復(fù)合物向增強(qiáng)因子的招募而導(dǎo)致疾病的，并揭示了治療干預(yù)的潛在節(jié)點(diǎn)。
圖1 g296s cms心臟功能受損。（a）流式分析來(lái)源于wt和g296s分化而來(lái)的、乳酸純化后的c替恩替+cms 。（b）cms的單細(xì)胞陣列的微圖(上)和α-actinin或f-actin的免疫染色(下)。（c）微觀模式的收縮測(cè)量。wt和g296s單厘米對(duì)1 hz起搏響應(yīng)的百分比（左圖）。牽引力顯微鏡測(cè)量力產(chǎn)生作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的cms對(duì)1hz起搏響應(yīng)的函數(shù)(右圖)。（d） wt和g296s cms的動(dòng)作電位測(cè)量。（e）微團(tuán)簇上鈣通量的測(cè)量。（f）特定微組織的鈣通量測(cè)量。（g）α-actinin染色觀察單個(gè)肉瘤類cms所占的百分比。（h）線粒體單厘米微模式染色強(qiáng)度(上圖)。定量測(cè)量細(xì)胞核分裂追蹤器相對(duì)于細(xì)胞面積的紅色強(qiáng)度(下圖)。（i）糖酵解功能測(cè)量。
圖2 gata4 - tbx5 grn顯示樞紐集中于pi3k信號(hào)。（a）gata4控制的grn（b）按基因符號(hào)命名的前20個(gè)樞紐的子網(wǎng)絡(luò)圖（c）在pi3k信號(hào)被抑制(圓形)或激活(三角形)后iwt(黑色)和g296s(紅色)cms產(chǎn)生的相對(duì)變化（d）pi3k信號(hào)被抑制(圓形)或激活(三角形)后，iwt(黑色)和g296s(紅色)cms的搏動(dòng)率測(cè)量（e）假設(shè)模型。上圖，wt基因的心臟基因位點(diǎn)開放且允許g4t5與med1結(jié)合的se元件結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄;g4t5和hdac2抑制異常內(nèi)皮基因轉(zhuǎn)錄。下圖，gata4 g296s的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳結(jié)果。心臟基因座降低了開放染色質(zhì)和tbx5與se元素的結(jié)合，降低了轉(zhuǎn)錄;異常開放的染色質(zhì)缺失了gata4-hdac2，但tbx5富集，同時(shí)ets因子的基序?qū)е聝?nèi)皮基因轉(zhuǎn)錄沉默失敗，其他參與間隔發(fā)育的位點(diǎn)未描述。
研究意義
本研究表明，適當(dāng)?shù)男呐K發(fā)育和功能需要med1結(jié)合的h3k27ac標(biāo)記se元素的gata4-tbx5的共同參與，以維持開放的染色質(zhì)狀態(tài)并激活心源性基因轉(zhuǎn)錄。雜合性gata4錯(cuò)義突變影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，tbx5無(wú)法募集到se元件與未能保持開放的染色質(zhì)狀態(tài)以及心臟基因的轉(zhuǎn)錄降低有關(guān)。gata4 g296s突變?cè)试Stbx5和其他轉(zhuǎn)錄激活因子的錯(cuò)誤定位，導(dǎo)致無(wú)法招募到hdac2，并在內(nèi)皮啟動(dòng)子上實(shí)現(xiàn)更封閉的染色質(zhì)特征。結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)皮基因表達(dá)的異常激活和譜系改變。參與shh信號(hào)接收和心臟分離的基因失調(diào)為gata4 g296s患者的三維間隔缺損提供了分子基礎(chǔ)。這些研究揭示了tf復(fù)合物如何通過(guò)協(xié)同調(diào)控反式作用因子的全基因組定位來(lái)控制基因表達(dá)的激活和抑制，以及當(dāng)協(xié)同性被破壞時(shí)疾病是如何發(fā)生的。
這一研究結(jié)果解釋了一個(gè)啟動(dòng)人類心臟基因程序的組合tf結(jié)合密碼子，并揭示了通過(guò)錯(cuò)義突變破壞該密碼子如何導(dǎo)致表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄失調(diào)和人類疾病。atac-seq分析開放染色質(zhì)特征和gata4和tbx5結(jié)合位點(diǎn)的全基因組分析提供了人類tf結(jié)合增強(qiáng)子的詳細(xì)目錄，并補(bǔ)充了稀缺心臟細(xì)胞類型的編碼數(shù)據(jù)，同時(shí)利用這些數(shù)據(jù)鑒定了一個(gè)假定的g4t5輔抑制子。綜上所述，本研究揭示了一個(gè)組合的tf代碼，這一代碼確保了一個(gè)強(qiáng)大的心臟基因程序，闡明了當(dāng)通過(guò)干擾該代碼的tf協(xié)同性時(shí)人類疾病是如何發(fā)生的，并提出了治療干預(yù)的潛在節(jié)點(diǎn)。
本實(shí)驗(yàn)中特別涉及了一種細(xì)胞培養(yǎng)和測(cè)量手段
ips-cms細(xì)胞的體外培養(yǎng)
將細(xì)胞接種在聚丙烯酰胺水凝膠裝置上，該裝置具有基質(zhì)凝膠微結(jié)構(gòu)。由縮印手段在水凝膠表面制備長(zhǎng)寬比為7:1、面積為2000平方微米的矩形凹槽。這些特定的微結(jié)構(gòu)具備一定的剛度及形狀，有利于模擬體內(nèi)cms的真實(shí)環(huán)境，可原位培養(yǎng)并分析單個(gè)cms。之后，可用牽引力顯微鏡計(jì)算細(xì)胞附著在聚丙烯酰胺表面所產(chǎn)生的力。
單個(gè)cms收縮力測(cè)量
在水凝膠中混入熒光微珠，使用zeiss倒置顯微鏡測(cè)試收縮cms的明場(chǎng)視頻以及因細(xì)胞收縮而移動(dòng)的綠色熒光微珠的視頻。明場(chǎng)視頻被用來(lái)計(jì)算每個(gè)收縮周期的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及平均位移。熒光微珠視頻則提交到牽引力顯微鏡算法來(lái)計(jì)算收縮力。
鈣通量分析，膜片鉗測(cè)試
fluo-4染色后采用延時(shí)成像技術(shù)來(lái)測(cè)量鈣通量。選擇自發(fā)收縮的微團(tuán)簇的特定區(qū)域，用軟件量化動(dòng)作電位之間測(cè)量到的鈣瞬變表達(dá)相對(duì)于基線熒光的峰值振幅。采用全細(xì)胞膜片鉗在單細(xì)胞水平測(cè)量cms的動(dòng)作電位
作為實(shí)驗(yàn)前置內(nèi)容，細(xì)胞培養(yǎng)與力學(xué)、鈣通量測(cè)試在后續(xù)基因表達(dá)分析工作中起到了關(guān)鍵性的作用。在該工作中使用的是英國(guó)plexithermo的hcells高通量單細(xì)胞、器官功能測(cè)量及納米水凝膠3d培養(yǎng)系統(tǒng)。
該系統(tǒng)可使用多種定制水凝膠耗材模擬細(xì)胞微環(huán)境，亦可以自行設(shè)計(jì)蝕刻水凝膠以滿足不同的研究需求，尤其適用于心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境的構(gòu)建。搭配unique的細(xì)胞追蹤技術(shù)，可短時(shí)間內(nèi)測(cè)量300個(gè)以上細(xì)胞的收縮及離子濃度變化情況。搭配多孔位細(xì)胞培養(yǎng)板，實(shí)現(xiàn)真正的高通量細(xì)胞測(cè)試，每個(gè)孔位即可作為一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)，不同孔位同時(shí)培養(yǎng)，同時(shí)測(cè)量，極大節(jié)省時(shí)間及耗材。
適用范圍：
1、心肌細(xì)胞
采用超速成像納米水凝膠技術(shù)，可wanmei模擬器官硬度。批量測(cè)心肌細(xì)胞的力學(xué)指標(biāo)和離子濃度變化。包括細(xì)胞收縮速度和力度、收縮功率，收縮角度，速度差和力差等，
2、細(xì)胞遷移和精子運(yùn)動(dòng)軌跡
跟蹤檢測(cè)細(xì)胞軌跡，并可計(jì)算定量數(shù)據(jù)，如：運(yùn)動(dòng)軌跡，距離和速度。
3、動(dòng)態(tài)跟蹤細(xì)胞增殖的情況，如菌落形成。
4、人ips細(xì)胞衍生神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞活力測(cè)定：神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)的功率譜密度（psd）可，用于準(zhǔn)確預(yù)測(cè)細(xì)胞死亡。psd表示一個(gè)單元在頻域中的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，能夠更精確地預(yù)測(cè)細(xì)胞死亡。
5、核跟蹤特征可用于分析癌細(xì)胞遷移
6、測(cè)量對(duì)象：癌細(xì)胞、斑馬魚、精子、菌落、貼壁細(xì)胞（如：急性分離的成年小鼠細(xì)胞，乳鼠細(xì)胞、成年大鼠的心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等）。
參考文獻(xiàn)：
ang y s , rivas r n , ribeiro a j s , et al. disease model of gata4 mutation reveals transcription factor cooperativity in human cardiogenesis[j]. cell, 2016, 167(7):1734-1749.e22.