fff簡(jiǎn)介分子之間的能量轉(zhuǎn)移大多是由輻射導(dǎo)致的。然而當(dāng)不同熒光物質(zhì)非常靠近時(shí)（<10nm），會(huì)發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移（ret）。熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fret）是一種的型的 ret現(xiàn)象。
圖1所示在 fret中，使用強(qiáng)光照射以激發(fā)供體能量，處于激發(fā)態(tài)的供體將一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給
受體，受體被激發(fā)。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能量轉(zhuǎn)移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射
體，則呈現(xiàn)出受體的熒光。光照下很多熒光物質(zhì)會(huì)逐漸失去其熒光特性，這種現(xiàn)象被稱為光漂白。為了提高靈敏度，近期生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bret）得到了廣泛應(yīng)用1。bret使用生物發(fā)光物質(zhì)代替了熒光供體。由于bret不在需要直射光線以激發(fā)供體，不存在放射性的能量轉(zhuǎn)移，所以避免了對(duì)樣品的損害（如圖2）。熒光素酶是一種螢火蟲(chóng)體內(nèi)的生物發(fā)光酶，被廣泛用于 bret研究2。本實(shí)驗(yàn)中，選擇luc8（海腎熒光
素酶）作為供體（圖3），該物質(zhì)由海腎（renillareinformis）基因突變而來(lái)。如圖4所示，luc8 的生物
熒光峰值接近480nm。
圖2：bret示意圖
圖 3：海腎（左）和luc8蛋白結(jié)構(gòu)（右）
圖 4：luc8的發(fā)射光譜右）
本實(shí)驗(yàn)中，使用了四種類型的量子點(diǎn)（605、655、705和800）：它們具有高量子產(chǎn)率，并適用于多種熒光波長(zhǎng)（圖5）。這些量子點(diǎn)在較大的波長(zhǎng)范圍內(nèi)都有吸收，但是在605、655、705和800nm時(shí)發(fā)出的熒光較強(qiáng)。
圖 5：量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)（左）和熒光（右）
發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)于強(qiáng)光直射產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度較弱，同時(shí)使用微量比色皿獲得的光量較小。為了在測(cè)量 bret時(shí)能夠更加地收集光，本實(shí)驗(yàn)使用了發(fā)光微量池支架，該配件可zui大程度減少微量池與發(fā)射透鏡之間的距離（圖6）。
試劑和儀器
1.lumina熒光分光光度計(jì)
2.發(fā)光微量池支架
3.pbs緩沖液0.1m（ph 7.4）
4.luc8 150 m
5.量子點(diǎn)605、655、705、800 8 m（invitrogen）
6.腔腸素h 1 g/ l 甲醇溶液（promega）
7.nicl2 100 m 蒸餾水溶液（sigma aldrich）
8.10 l 微量離心管
9.45 l 熒光微量池
10.吸液管和吸液頭
11.渦旋混合器
實(shí)驗(yàn)步驟
1.準(zhǔn)備4個(gè)10 l 微量離心管。
2.在每個(gè)離心管內(nèi)填充94 l pbs 緩沖液和1 l luc8（供體）。
3.在每個(gè)離心管中添加5 l量子點(diǎn)605、655、705、800（受體）。
4.在每個(gè)離心管中注入2 l nicl2溶液（供體和受體之間的結(jié)合試劑），并在充分混合。
5.將發(fā)光微量池支架安裝到lumina上，注入樣品并插到支架上。
6.打開(kāi)luminous wavescan 軟件，輸入設(shè)定參數(shù)，點(diǎn)51擊應(yīng)用（apply）（圖7）。
7.使用吸液管注入2 l腔腸素h，迅速合攏測(cè)試艙蓋，點(diǎn)擊開(kāi)始按鈕。
8.應(yīng)用基線校正功能對(duì)測(cè)得的光譜進(jìn)行校正。單擊基線校正（baseline correction）圖標(biāo)，使用具有zui低生物發(fā)光強(qiáng)度的波長(zhǎng)進(jìn)行基線校正（圖8）。
9.根據(jù)luc8峰值對(duì)光譜進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，比較量子點(diǎn)峰值。為了標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各個(gè)轉(zhuǎn)換標(biāo)量，使得所有l(wèi)uc8峰值強(qiáng)度相等。然后單擊標(biāo)量計(jì)算器（scalar calculator）圖標(biāo)，通過(guò)乘以轉(zhuǎn)換標(biāo)量對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換（圖9）。
儀器參數(shù)
圖 7：波長(zhǎng)掃描測(cè)量條件
圖 8：基線校正窗口
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
從測(cè)得的光譜上，可以觀察到bret現(xiàn)象，luc8與各量子點(diǎn)發(fā)生了生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移（圖10）。由于多重量子點(diǎn)結(jié)合可在單個(gè)波長(zhǎng)條件下產(chǎn)生多種波長(zhǎng)，因此使用量子點(diǎn)的bret對(duì)分子診斷和成像領(lǐng)域均有很大助。bret 能量轉(zhuǎn)移的效率的因素有：（1）供體和受體之間的間隔距離；（2）供體發(fā)射和受體激發(fā)光譜的重疊。通過(guò)比較使用luc8峰值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正的光譜，我們可以證實(shí)量子點(diǎn)665-luc8結(jié)合物在多個(gè)結(jié)合物中產(chǎn)生的bret效率zui高。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
thermo fisher公司的lumina熒光分光光度計(jì)和發(fā)光微量池架配件有助于檢查bret，其產(chǎn)生的噪音要小于fret。此外，實(shí)驗(yàn)證明根據(jù)量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)的不同，bret現(xiàn)象可應(yīng)用于較廣的波長(zhǎng)范圍。