重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，rpa）是piepenburg等人在2006年利用參與細(xì)胞dna合成的蛋白重組和修復(fù)開發(fā)出的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實(shí)現(xiàn)待測(cè)靶標(biāo)的快速檢測(cè)。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器依賴程度低且可整合多種檢測(cè)模式等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[1]。
一、rpa技術(shù)原理rpa技術(shù)主要依賴于能結(jié)合寡核苷酸引物的t4噬菌體來源的重組酶t4 uvsx、單鏈結(jié)合蛋白gp32和鏈置換bsu dna 聚合酶以及兩條特異性的上下游引物實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，具體擴(kuò)增原理如圖1所示：
圖1.重組酶聚合酶擴(kuò)增rpa技術(shù)擴(kuò)增原理圖[2]
1.重組酶引物復(fù)合體的形成：重組酶t4 uvsx在atp的參與和定位因子（t4 uvsy）的幫助下與擴(kuò)增引物結(jié)合形成重組酶引物復(fù)合體，并在雙鏈dna中尋找同源序列；
2.重組酶引物復(fù)合體定位至同源序列：重組酶引物復(fù)合體一旦定位到同源序列，則會(huì)插入雙鏈dna形成d-環(huán)結(jié)構(gòu)，啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，單鏈結(jié)合蛋白gp32會(huì)與解開的dna鏈結(jié)合防止進(jìn)一步被置換。
3.鏈置換擴(kuò)增啟動(dòng)：重組酶t4 uvsx從重組酶引物復(fù)合體中被水解，3'端引物暴露并與bsu dna聚合酶結(jié)合，dna開始復(fù)制延伸，最終兩條母鏈分離，形成兩條新的互補(bǔ)雙鏈dna。該反應(yīng)在37-42℃下進(jìn)行，可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列1012倍的擴(kuò)增。
二、rpa技術(shù)優(yōu)勢(shì)1. 檢測(cè)靈敏度高：可將痕量的核酸模板（低至單拷貝）擴(kuò)增至可以檢出的水平，且通常無需進(jìn)行核酸純化。2. 無需昂貴的配套儀器設(shè)備：37~42°c恒溫反應(yīng)，無須熱循環(huán)，擺脫儀器束縛，方便快捷。3. 樣本耐受性高：適合復(fù)雜樣本的擴(kuò)增檢測(cè)。例如未經(jīng)核酸純化的血液或鼻拭子，只需要通過熱或堿進(jìn)行預(yù)處理促進(jìn)核酸釋放即可。4. 檢測(cè)方法多樣化：包括電泳法檢測(cè)、熒光探針法檢測(cè)、側(cè)流層析試紙條檢測(cè)等。
三、rpa技術(shù)應(yīng)用rpa技術(shù)可用于不同種類的目標(biāo)生物檢測(cè)，如細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物等的雙鏈dna、單鏈dna、甲基化dna以及通過rna或mirna反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cdna等核酸樣本。rpa技術(shù)目前已被成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品、疫病防控等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。
圖2.rpa技術(shù)應(yīng)用
四、rpa技術(shù)核心酶原料翌圣zymeeditor™酶改造平臺(tái)針對(duì)rpa技術(shù)，目前已獲得rpa全系列性能優(yōu)良的產(chǎn)品，包括鏈置換bsu dna polymerase、t4 uvsx recombinase、t4 uvsy protein、t4 gene 32 protein、肌酸激酶creatine kinase和exonuclease iii。
翌圣rpa產(chǎn)品選擇指南
產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品貨號(hào) 產(chǎn)品作用
bsu dna polymerase (large fragment, 5 u/μl) 11078es 結(jié)合引物與原始靶核酸序列互補(bǔ)合成新的dna模板
t4 uvsx recombinase (2 μg/μl) 11079es 具有配對(duì)和鏈轉(zhuǎn)移活性的重組酶
t4 uvsy protein (2 μg/μl) 11080es 重組酶輔助因子，刺激t4 uvsx的單鏈dna依賴性atp酶活性并降低活性所需的t4 uvsx臨界濃度
t4 gene 32 protein (gp 32) t4噬菌體基因32編碼蛋白 11081es 參與dna復(fù)制、修復(fù)、重組與解鏈后的單鏈dna結(jié)合，防止自雜交
creatine kinase (2 μg/μl) 肌酸激酶 14502es 刺激atp和肌酸分解為磷酸肌酸和adp，釋放能量
exonuclease iii (100 u/μl) 14525es 具有3’→5’外切酶活性，切斷熒光探針中淬滅基團(tuán)，釋放熒光
客戶測(cè)試案例展示
客戶采用翌圣bsu dna polymerase (large fragment, 5 u/μl)、t4 uvsx recombinase (2 μg/μl)、t4 uvsy protein (2 μg/μl)、t4 gene 32 protein (gp 32)、肌酸激酶creatine kinase (2 μg/μl) 進(jìn)行rpa擴(kuò)增反應(yīng)，得到正確的目的條帶，且條帶清晰、明亮，結(jié)果表明，pra技術(shù)核心酶原料可實(shí)現(xiàn)高效rpa等溫?cái)U(kuò)增。
圖3 客戶測(cè)試翌圣重組酶聚合酶核心酶原料擴(kuò)增結(jié)果圖
注：2、4為陽性實(shí)驗(yàn)組；1、3為陰性對(duì)照組
參考文獻(xiàn)
[1] zhao y, chen f, li q, wang l, fan c. isothermal amplification of nucleic acids. chem rev. 2015 nov 25;115(22):12491-545. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00428. epub 2015 nov 9. pmid: 26551336.
[2] 王亞楠, 陳昌國. 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展[j]. 醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 46(5):8.