提要 安吉白茶(camellia sinensis)是具有階段性返白現(xiàn)象的溫敏突變體。利用sds-page電泳分析了返白和復(fù)綠過(guò)程中各階段葉片可溶性蛋白組分，尤其是rubp羧化酶大、小亞基的變化，并利用同位素法測(cè)定了此過(guò)程中rubp羧化酶活性的變化。利用內(nèi)源基質(zhì)法測(cè)定了蛋白酶活性的變化，并分析了其變化與蛋白質(zhì)源庫(kù)代謝、葉綠素變化之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)安吉白茶在返白與復(fù)綠過(guò)程中葉片可溶性蛋白的主要變化是rubp羧化酶大、小亞基含量上的差異，這種差異與rubp羧化酶活性的變化是相一致的。同時(shí)返白階段蛋白酶活性較高，可溶性蛋白含量降低，是造成游離氨基酸總量明顯積累的直接原因。
關(guān)鍵詞 安吉白茶；階段性返白；溫敏突變體；蛋白酶； rubp羧化酶
studies on the stage albescent phenomenon in tea
——the changes of rubpcase and proteinase
li sufang chen ming yu fulian cheng hao
(tea research institute, chinese academy of agricultural sciences, hangzhou 310008)
abstract the variation of large and small subunits of rubpcase from temperature-sensitive mutant of anjibaicha (camellia sinensis) during its stage albescent process was investigated as well as the changes of the enzyme activities. the relationship between the levels of the rubpcase subunits and the activities of proteinase was also discussed. it was found the levels of both large and small subunits were low at the albescent stage and became normal after leaves recovered to green, which corresponded with the enzyme activity change. meanwhile, the high activity of protease and the lowering of leaf soluble protein content. at the albescent stage were the direct reasons for the accumulation of free amino acids.
key words anjibaicha；stage albescent mutation；temperature sensitive mutant；proteinase； rubpcase
我們業(yè)已報(bào)道了溫敏葉色突變體安吉白茶在返白過(guò)程中伴隨著葉片色素含量的可逆性變化，其茶多酚含量、氨基酸含量與組成等都有對(duì)應(yīng)的相關(guān)變化〔1，2〕，尤其是返白階段的氨基酸總量比對(duì)照品種高出許多，使以此突變體為原料制作的成品茶滋味較為鮮爽；不僅如此，在返白與復(fù)綠過(guò)程中還有葉綠體數(shù)量分布和葉綠體超微結(jié)構(gòu)〔3〕的可逆性變化。但以安吉白茶無(wú)性系群體所產(chǎn)的種子進(jìn)行繁殖的有性后代在白化性狀上出現(xiàn)了分離，大多數(shù)種子后代不再具有返白特征，只有少量種子苗能保持其返白現(xiàn)象。本文主要探討了在安吉白茶返白與復(fù)綠過(guò)程中，葉片rubp羧化酶和蛋白酶的變化情況。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
種植在杭州中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所苗圃和浙江省安吉縣林科所白茶基地的無(wú)性系安吉白茶茶苗。并采用種植于本所苗圃的安吉白茶部分實(shí)生綠苗作為可溶性蛋白組分分析的對(duì)照材料。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 葉片可溶性蛋白組分分析
1.2.1.1 葉片可溶性蛋白提取 白茶和對(duì)照樣各500mg，液氮凍干。加3.5ml可溶性蛋白提取液(30mmol／l tris-hcl，ph 8.7；1mmol／l dtt；1mmol／l edta；5mmol／l mgcl2)、0.1g水不溶性聚乙烯吡咯烷酮(pvp)及少量石英砂，冰浴研磨。4℃，8640r／min離心10min。取200μl，加1ml冷丙酮（內(nèi)含10mmol／l巰基乙醇），搖勻后置于-20℃冰箱1h，用tgl-16離心機(jī)10000r／min離心5 min，收集沉淀，減壓干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?br>1.2.1.2 可溶性蛋白sds-page凝膠電泳〔8〕 濃縮膠濃度3%，分離膠濃度12%，含0.1%sds。電泳后，凝膠用0.25%考馬斯亮藍(lán)r250、50%甲醇、10%乙酸固定染色6h，然后用7%乙酸和15%甲醇脫色。膠片用島津cs-930薄層掃描儀595nm波長(zhǎng)掃描。分子量測(cè)定用低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白含兔磷酸化酶b(97400 u)、牛血清白蛋白(66200 u)、兔肌動(dòng)蛋白(43000 u)、牛碳酸酐酶(31000 u)，胰蛋白酶抑制劑(20100 u)和雞蛋清溶菌酶(14400 u)。
1.2.1.3 可溶性蛋白含量、蛋白酶活性與游離氨基酸測(cè)定 可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法〔6〕，在島津uv-265分光光度計(jì)上測(cè)吸光值，并計(jì)算蛋白濃度。蛋白酶活性測(cè)定采用內(nèi)源基質(zhì)法〔7〕。游離氨基酸含量測(cè)定用國(guó)標(biāo)法gb8312-87。
1.2.2 rubp羧化酶提取及酶活力測(cè)定
1.2.2.1 rubp羧化酶提取〔4,9〕 鮮葉去葉脈，液氮冷凍24h，再保存于-30℃冰柜待用。取10g上述保存的材料，加入80ml預(yù)冷的新鮮提取液（50mmol／l磷酸緩沖液，ph7.4，內(nèi)含1mmol／l edta，5mmol／l巰基乙醇，10%甘油)，及2g水不溶性pvp，預(yù)冷的組織搗碎機(jī)勻漿，快速5s，慢速5s，重復(fù)3次。然后經(jīng)4層預(yù)冷紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)11900r／min離心20min，收集上清。
1.2.2.2 rubp羧化酶活力測(cè)定 采用同位素方法測(cè)定?？傮w積為800μl的反應(yīng)混合液含100μmol tris-hcl緩沖液(ph7.8)，10μmol mgcl2，8μmol nah14co2 (2μci)，2μmol dtt和100μl上述提取的rubpcase酶液。25℃預(yù)溫10min使酶活化，加入0.5μmol rubp使反應(yīng)開(kāi)始。5min后，加入800μl hcl終止反應(yīng),90℃烘箱干燥。packard 1900ca雙道液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定，按以下公式計(jì)算酶活力：
u=dpm×3.997×60×v／(2.22×106×5×10-1)(co2μmol.g-1.h-1fw)
式中：3.997為每微居里(μci)14c相當(dāng)于co2的微摩爾數(shù)(μmol)；60為分鐘數(shù)(min)；v為每克鮮重植物得到的酶液原液的體積(ml)；2.22×106為每分鐘內(nèi)1μci14c的蛻變數(shù)；5為反應(yīng)時(shí)間(min)；10-1為反應(yīng)體積中酶液的體積(ml)。
2 結(jié)果與分析
2.1 葉片可溶性蛋白的電泳分析
葉片可溶性蛋白組分測(cè)定材料為本所苗圃3年生茶苗，自4月9日起每隔一周取樣至5月16日葉片復(fù)綠時(shí)止。各時(shí)期樣品電泳后進(jìn)行比較，未能發(fā)現(xiàn)有明顯的組分變化，僅發(fā)現(xiàn)有兩條帶的強(qiáng)度在不同時(shí)期有顯著差異。將電泳膠片在薄層掃描儀上掃描后，其結(jié)果(圖1)證實(shí)這兩條帶的含量在白化期與復(fù)綠后差異較大。根椐與低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的對(duì)比計(jì)算，確定它們的分子量分別為54.2ku和14.9ku左右。經(jīng)與菠菜rubp羧化酶提純品的多次比較，確認(rèn)其為rubp羧化酶大、小亞基。由圖1可見(jiàn)，白茶突變體rubp羧化酶大、小亞基含量在白化初期與全白期均處于較低水平，復(fù)綠后急劇升高，兩個(gè)亞基的變化幅度基本相近。
因?yàn)榘布撞柰蛔凅w原發(fā)現(xiàn)于安吉山區(qū)一農(nóng)家茶園，已無(wú)法找到產(chǎn)生這一突變體的原茶樹(shù)種群來(lái)作為對(duì)照，為確證這種rubp羧化酶大、小亞基含量的變化確實(shí)是與突變體的返白性狀有關(guān)，而不是葉片本身發(fā)育的原因，選擇了安吉白茶突變體的種子后代中不表現(xiàn)返白特性的植株作為對(duì)照，對(duì)比了突變體與其有性后代在各時(shí)期rubp羧化酶大、小亞基含量上的差別。種子后代葉片可溶性蛋白電泳膠片的掃描結(jié)果如圖2所示。根椐電泳圖譜的對(duì)比，也未能發(fā)現(xiàn)白茶突變體與其有性后代在葉片可溶性蛋白組分上有明顯差異，但作為對(duì)照的突變體有性后代rubp羧化酶兩亞基在各時(shí)期的水平基本沒(méi)有變化，與白茶復(fù)綠期水平接近，大大高于白茶返白期水平。該結(jié)果與對(duì)照植株不表現(xiàn)白化突變的現(xiàn)象一致，說(shuō)明白茶rubp羧化酶亞基的含量變化確實(shí)是由突變引起的。
ea：返白初期；fa：全白期；hg：復(fù)綠中期；fg：全復(fù)綠期；ls：rubp羧化酶的大亞基；ss：rubp羧化酶的小亞基
ea: early albescent stage; fa: fully albescent stage; hg: half green stage; fg: fully green stage；ls: the large subunit of rubpcase; ss: the small subunit of rubpcase
圖 1 安吉白茶突變體返白過(guò)程不同階段葉片可溶性蛋白sds-page電泳結(jié)果掃描圖
fig.1 sds-page scanning profiles of soluble leaf proteins during anjibaicha albescent progress
ea：相當(dāng)于白茶返白初期； fa：相當(dāng)于白茶全白時(shí)期；fg：相當(dāng)于白茶全復(fù)綠時(shí)期；ls：rubp羧化酶的大亞基；ss：rubp羧化酶的小亞基
ea: the same time to early albescent stage; fa: the same time to fully albescent stage;fg: the same time to fully green stage；ls: the large subunit of rubpcase; ss: the small subunit of rubpcase
圖 2 安吉白茶有性后代不同階段葉片可溶性蛋白sds-page電泳結(jié)果掃描圖
fig.2 sds-page scanning profiles of the soluble leaf proteins of anjibaicha seedling progenies
2.2 返白過(guò)程中rubp羧化酶的活性變化
為進(jìn)一步確證rubp羧化酶在返白與復(fù)綠過(guò)程中的變化，采用同位素方法測(cè)定了白茶突變體返白過(guò)程各時(shí)期rubp羧化酶的活性。其結(jié)果(圖3)表明該酶活性在返白初期即較低，隨葉片返白程度的加深又略有下降，然后又隨葉片的逐步復(fù)綠而漸漸升高，其變化趨勢(shì)與返白過(guò)程中葉綠素的變化完全一致。這一結(jié)果不僅與葉片可溶性蛋白的電泳結(jié)果一致，也和已觀察到的返白復(fù)綠過(guò)程中葉綠體結(jié)構(gòu)的解體與恢復(fù)現(xiàn)象〔3〕一致，說(shuō)明安吉白茶在返白期葉綠體的結(jié)構(gòu)與功能同時(shí)受到了嚴(yán)重的破壞，而在復(fù)綠期又得到了重建。
ea：返白初期；fa：全白期；sg：復(fù)綠初期； hg：復(fù)綠中期；fg：全復(fù)綠期
ea: early albescent stage; fa: fully albescent stage; sg: slightly green stage; hg: half green stage; fg: fully green stage
圖 3 安吉白茶不同返白復(fù)綠階段rubp羧化酶活性的變化
fig.3 variation of rubpcase activity at the different albescent stages of anjibaicha
2.3 返白過(guò)程中蛋白酶的變化
rubp羧化酶大、小亞基含量的同時(shí)下降提示我們需對(duì)蛋白的降解作一分析，為此測(cè)定了白茶突變體返白與復(fù)綠各階段蛋白水解酶的活性、可溶性蛋白含量和游離氨基酸總量。其結(jié)果(圖4)表明，與隨后的復(fù)綠階段相比，返白期蛋白水解酶活性總體較高，可溶性蛋白含量較低，兩者有較好的負(fù)相關(guān)性；而總游離氨基酸明顯積累，其峰值與蛋白水解酶活性最大值幾乎同時(shí)出現(xiàn)。而復(fù)綠后蛋白水解酶活性逐步降低；與此對(duì)應(yīng)，可溶性蛋白含量隨復(fù)綠過(guò)程逐步升高，同時(shí)游離氨基酸含量下降，游離氨基酸庫(kù)容的變化與可溶性蛋白含量變化呈較好的負(fù)相關(guān)性。因此安吉白茶在返白階段游離氨基酸庫(kù)容的增大，很可能是由于蛋白酶活性的增大，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)的大量水解引起。
ea：返白初期；fa：全白期；hg：半復(fù)綠期；fg：全復(fù)綠期
ea: early albescent stage; fa: fully albescent stage; hg: half green stage; fg: fully green stage
圖 4 安吉白茶不同返白復(fù)綠階段可溶性蛋白,游離氨基酸和蛋白酶活性變化
fig.4 variation of proteinase activity, soluble protein level and free amino acid content at the different albescent stage of anjibaicha
3 討論
rubp羧化酶是一種重要的葉蛋白，幾乎占葉片可溶性蛋白的50%左右，催化光合作用中co2的固定。安吉白茶在返白與復(fù)綠過(guò)程中葉片可溶性蛋白的主要變化是rubp羧化酶大、小亞基含量上的差異，這種差異與rubp羧化酶活性的變化是相一致的，與返白過(guò)程中蛋白酶活性的變化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。許多學(xué)者認(rèn)為，rubp羧化酶是植物蛋白酶水解的最佳底物，因此造成rubp羧化酶大、小亞基含量在白化期下降的原因，很可能是由于突變誘發(fā)的蛋白酶活性升高導(dǎo)致了rubp羧化酶蛋白的大量水解。因此，蛋白酶活性在白化期的顯著上升是安吉白茶白化期氨基酸總量增加的直接原因。
高等植物的rubp羧化酶是一個(gè)由核基因和質(zhì)體基因共同編碼的基因產(chǎn)物，其大亞基的合成由葉綠體基因組中單一基因編碼，而小亞基的合成則由核基因組中的多基因編碼。在水稻中，由葉綠體基因組缺失所導(dǎo)致的花培白化苗，其rubp羧化酶大亞基水平極低而小亞基較為正常〔5〕，而核基因突變產(chǎn)生的水稻白綠苗〔5〕，則兩個(gè)亞基同時(shí)受到影響。安吉白茶在其返白與復(fù)綠過(guò)程中，rubp羧化酶大、小亞基含量基本上同時(shí)下降與上升，與水稻白綠苗的情形較為類似。且其種子后代中只有少量種子苗能夠保持返白特征，因此安吉白茶的返白突變不可能是僅僅由于質(zhì)體基因組突變產(chǎn)生。
*國(guó)家自然科學(xué)基金與浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目。
作者單位：李素芳 陳 明 虞富蓮 成 浩 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，杭州 310008
參考文獻(xiàn)
1 李素芳，成 浩，虞富蓮，晏 靜. 安吉白茶階段性返白過(guò)程中氨基酸的變化. 茶葉科學(xué). 1996, 16(2):153～154
2 成 浩，李素芳. 安吉白茶階段性返白突變的氣候調(diào)控因子. 中國(guó)青年農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)術(shù)年報(bào). 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997, (a卷):572～577
3 李素芳，陳樹(shù)堯，成 浩. 茶樹(shù)階段性返白現(xiàn)象的研究——葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化. 茶葉科學(xué). 1995, 15(1):23～26
4 王維光，李立人．菠菜二磷酸核酮糖(rubp)羧化酶簡(jiǎn)化提純研究．植物生理學(xué)報(bào)．1980，6(3)：257～261
5 楊 煒，錢 前，黃大年. 水稻白綠苗可轉(zhuǎn)化性與核酮糖1,5-二磷酸羧化酶／加氧酶小亞基的關(guān)系. 科學(xué)通報(bào). 1982, 20:1897～1900
6 吳如月. 溶液中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定.蛋白質(zhì)和酶學(xué)研究方法(第一冊(cè)).魯子賢主編. 北京：科學(xué)出版社， 1989：5～7
7 x h 波欽諾克著. 荊家海，丁鐘榮譯. 植物生物化學(xué)分析方法. 北京:科學(xué)出版社，1981: 221～224
8 laemmli u k. cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4. nature. 1970, 227:680～685
9 amane makino, tadahiko mae, koji ohira. purification and storage of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase from rice leaves. plant & cell physiol. 1983, 24(6):1169～1173