概述
香蘭素（圖 1）是天然香草的主要成分，是世界范圍內(nèi)使用非常廣泛和非常重要的調(diào)味材料之一。
香蘭素可以從熱帶香草蘭(主要是 vanilla planifolia andrews) 1的豆子或豆莢中提取、重組生產(chǎn)或合成。食品配方中使用的純香蘭素的來(lái)源可以通過(guò)其同位素特征2來(lái)區(qū)分。該方法可能需要先進(jìn)行初步純化。
在本研究中，使用香草的乙醇粗提物來(lái)對(duì)比verity® plc 2050 系統(tǒng)與不同類型色譜柱配合使用的能力。在 hplc 制備柱和 cpc pro 上進(jìn)行香蘭素（vanillin）的制備純化。對(duì)比了兩種技術(shù)所獲取最終的香蘭素純度、溶劑消耗和進(jìn)樣量。
離心分配色譜技術(shù)是什么？
它全稱centrifugal partition chromatography, 由nunogaki發(fā)明，簡(jiǎn)稱cpc。cpc屬于現(xiàn)代逆流色譜技術(shù)的一種，它和滴流逆流色譜（dccc）、旋轉(zhuǎn)腔式逆流色譜（rlccc）以及回旋腔室逆流色譜（glccc）等同屬于非螺旋管式的逆流色譜。
離心分配色譜技術(shù)的原理
和以硅膠顆粒等材質(zhì)作為固定相以及有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相的傳統(tǒng)hplc色譜有所不同，離心分配色譜技術(shù)的原理和液液萃取相似，都是利用待分離物質(zhì)在兩種互不相溶的有機(jī)溶劑中不同的溶解度作為基礎(chǔ)，將其中一種溶劑作為固定相，另外一種作為流動(dòng)相。
離心分配色譜的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)
離心分配色譜技術(shù)和利用色譜柱的制備色譜相比，其使用成本更低。最大的優(yōu)點(diǎn)就是為用戶節(jié)省了色譜柱這個(gè)耗材，cpc利用的是不銹鋼旋轉(zhuǎn)式分離柱，不需要頻繁的更換。cpc技術(shù)在對(duì)有機(jī)溶劑的消耗量上也更為節(jié)省，在分離過(guò)程中不需要使用大量的流動(dòng)相來(lái)沖洗色譜柱。
由于不使用硅膠顆粒這類較為脆弱的分離介質(zhì)，當(dāng)科學(xué)家采用離心分配色譜儀進(jìn)行目標(biāo)物的制備純化時(shí)，待分離的產(chǎn)物無(wú)需經(jīng)過(guò)前處理就可以直接進(jìn)樣。
cpc技術(shù)可以兼容多肽和蛋白質(zhì)的分離，沒(méi)有樣品損失，堅(jiān)實(shí)耐用，可以直接從實(shí)驗(yàn)方法向工業(yè)分離進(jìn)化。
離心分配色譜(cpc)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)
• 可從 6.3 g 粗提物獲得 500 mg 的純香蘭素，并進(jìn)一步同位素分析確認(rèn)其特性。
• 制備型高效液相色譜法與離心分離色譜法在香蘭素純化方面的比較。
解決的問(wèn)題
• 一套制備型液相系統(tǒng) (plc 2050) 可以同時(shí)適應(yīng)制備高效液相色譜法和離心分離色譜法。• 與制備高效液相色譜相比，離心分離色譜(cpc 250 pro) 是復(fù)雜提取物處理的更佳選擇。• 大幅度減少溶劑消耗，降低成本和對(duì)環(huán)境的影響
材料和方法
01.系統(tǒng)
純化儀器
圖 2 搭載離心分離色譜儀(左)的 plc 純化系統(tǒng) (右)
圖 3 裝載制備液相色譜柱的 plc 2050
gilson verity cpc 250 pro 離心分配色譜儀(圖2)， 或者 merck 公司的制備 hplc 色譜柱 hibar 250 x25, c18, 5μm (圖3) 連接到 gilson plc 2050 系統(tǒng), 該系統(tǒng)配有一臺(tái) 50 ml/min 的四元梯度泵，一臺(tái)紫外檢測(cè)器, 一臺(tái)餾分收集器及配套的 gilson glider 軟件。
分析儀器
配備波長(zhǎng)范圍200-800nm二極管陣列檢測(cè)器 (pda)的hplc系統(tǒng)
02.樣品
香草的乙醇粗提物首先進(jìn)行 hplc 分析 (表 1)。香蘭素在 rt = 9.9 分鐘出峰， 280 納米處峰值面積為 63.7%, (圖 4)。
表1 hplc分析條件
圖 4 粗提物在280nm的hplc分析色譜圖
通過(guò)外標(biāo)對(duì)照品校正， 粗提物種中香蘭素的含量約為 9% (w/w) 。提取物中大部分的分子沒(méi)有被紫外檢測(cè)到。
制備 28 g/l 的香蘭素提取物溶液用于離心分離色譜進(jìn)樣， 同時(shí)制備 0.08g/l 的低濃度樣品用于制備hplc，以避免進(jìn)樣壓力過(guò)高。
03.方法
制備高效液相色譜與離心分配色譜所運(yùn)行的方法分別詳見(jiàn)表 2 和表 3。當(dāng)使用制備高效液相色譜時(shí)，進(jìn)樣 90 mg 的粗油， 以 20ml/min 的流速等度洗脫。當(dāng)使用離心分離色譜時(shí)，進(jìn)樣 6.3 g 的粗油， 以30ml/min 的升相模式洗脫。
表2 制備液相色譜條件
表3 制備液相色譜條件
將純化后的產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行hplc 分析，在 280nm 下檢測(cè)香蘭素。
結(jié)果和討論
最終得到的制備色譜圖如圖 5 和圖 6 所示。兩個(gè)色譜圖中的藍(lán)色區(qū)域代表收集的香蘭素餾分。這些餾分進(jìn)一步使用 hplc 進(jìn)行分析，在 280nm 下的檢測(cè)結(jié)果如圖 7 和圖 8 所示。
圖 5 制備色譜在280nm處的紫外色譜圖
圖 6 verity cpc 250 pro在280nm處uv色譜圖
這些餾分進(jìn)一步使用 hplc 進(jìn)行分析，在 280nm 下的檢測(cè)結(jié)果如圖 7 和圖 8 所示。
圖 7 通過(guò)制備色譜柱純化，收集的香蘭素餾分合并后，在280nm處hplc分析圖譜
圖 8 通過(guò)verity cpc 250 pro離心分配色譜柱純化，收集的香蘭素餾分合并后，在280nm處hplc分析圖譜
兩種技術(shù)都能獲得純度大于 99% 的香蘭素（表 4）。此外，使用 cpc 的回收率大于 91.8%（表 4）。這表明 cpc 能夠避免由于潛在的不可逆吸附而導(dǎo)致的樣品損失。
在制備型 hplc 中洗脫香蘭素需要 500毫升溶劑（圖 5），而在 cpc 中洗脫香蘭素僅需使用 360 毫升溶劑（表 4）。由此可以得出，每進(jìn)樣 1 g的原料，制備型 hplc 需要使用 5.3 升的溶劑，而 cpc 只需要使用 0.1 升的溶劑。
本研究中由于制備型 hplc 的進(jìn)樣量低，無(wú)法得到回收的香蘭素的質(zhì)量和產(chǎn)率。
表 4 通過(guò)制備色譜法和離心分配色譜法對(duì)香蘭素進(jìn)行純化的結(jié)果對(duì)比
結(jié)論
plc 2050 能夠高效便捷地與 cpc 和 prep hplc 色譜柱搭配使用，用來(lái)進(jìn)行純化工作。在本文中， 通過(guò)對(duì)比 cpc 與 hplc 制備柱，展現(xiàn)了 cpc 的優(yōu)勢(shì)（表 4）。與 prephplc 相比， cpc 溶劑消耗量更低且無(wú)需固定相（如二氧化硅），進(jìn)樣量更大，而純化效率近似。這些基于實(shí)驗(yàn)室級(jí)儀器得到的純度，產(chǎn)量，產(chǎn)率等數(shù)據(jù)，可以放大并應(yīng)用到工業(yè)級(jí) cpc （如 gilson verity 工業(yè)級(jí) cpc ）解決方案。
參考文獻(xiàn)：1.vanillin; walton n.j. and al; phytochemistry, 63, (2003), 505-5152.zietlow et. al. journal of agricultural and food chemistry 50(22):6271-5