胰腺導(dǎo)管腺癌（pdac）很難在前期發(fā)現(xiàn)，因為它在無癥狀階段進(jìn)展迅速，能早期轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官。導(dǎo)致pdac預(yù)后不良的主要特征之一是結(jié)締組織增生，其形式為廣泛致密的纖維基質(zhì)和過量的細(xì)胞外基質(zhì)（ecm）。在ecm中，基質(zhì)金屬蛋白酶（mmps）由胰腺星狀細(xì)胞（pscs）和癌細(xì)胞分泌。在mmps的幾種亞型中，mmp2主要與促進(jìn)細(xì)胞生長和侵襲有關(guān)。
最近的研究表明，二甲雙胍是一種具有出色安全性的一線抗糖尿病藥物，可以在減少癌癥干細(xì)胞（cscs）的數(shù)量和各種癌細(xì)胞的遷移能力方面發(fā)揮作用。例如，在胰腺癌，乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤中，二甲雙胍已被證明可以在體外和體內(nèi)抑制腫瘤狀態(tài)。鑒于其安全性和低成本，二甲雙胍輔助治療可能是改善pdac預(yù)后的一個有吸引力的選擇。然而，對其益處機(jī)制的研究主要局限于細(xì)胞系，這些細(xì)胞系無法重現(xiàn)胰腺腫瘤微環(huán)境。
在胰腺中，pscs是促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中結(jié)締組織增生反應(yīng)的中樞細(xì)胞。既往研究報道，調(diào)控pscs可改善pdac的治療效果。因此，有理由將具有豐富基質(zhì)的pscs作為pdac的重要治療靶點，這些基質(zhì)有助于化學(xué)耐藥性和高侵襲性。
最近，在韓國成均館大學(xué)醫(yī)學(xué)院三星醫(yī)學(xué)中心內(nèi)分泌與代謝系、肝膽胰腺外科系以及大邱慶北醫(yī)療創(chuàng)新基金會的一項聯(lián)合研究中，著手確定了二甲雙胍在臨床相關(guān)濃度下的抗癌作用是否可以在由患者來源的pdac類器官和從術(shù)后組織獲得的原代人pscs制成的pdac三維（3d）共培養(yǎng)模型中得到證明。利用該模型，實驗探索了二甲雙胍對pscs的抗遷移作用的關(guān)鍵機(jī)制是否是由mmp2下調(diào)，以及口服二甲雙胍（30 mg/kg）是否可以抑制免疫抑制小鼠pdac類器官異種移植的生長。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 the american journal of cancer research 期刊題為“anti-cancer effects of metformin in a 3d co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma”。
首先，為了在體外探索人pdac的表型，從人pdac組織中分離出pscs和pdac類器官。
為了檢測二甲雙胍是否會影響與人 pscs 中遷移和侵襲相關(guān)基因的 mrna 轉(zhuǎn)錄水平，在接種細(xì)胞一天后向 psc 生長培養(yǎng)基中加入濃度為 1 μm、10 μm 和 100 μm 的二甲雙胍并處理 48 小時。結(jié)果表明，二甲雙胍處理的 pscs 表現(xiàn)出波形蛋白、mmp2 和金屬蛋白酶2組織抑制劑（timp2）的表達(dá)水平降低，這是遷移和侵襲的關(guān)鍵因子。二甲雙胍劑量依賴性地降低了cd10、cd24和cd44的轉(zhuǎn)錄水平，這是各種腫瘤的基質(zhì)預(yù)后標(biāo)志物?；诙縫cr分析，檢查了濃度為10 μm二甲雙胍的pscs的形態(tài)變化和細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)對照組和二甲雙胍處理組之間在48小時內(nèi)沒有顯著差異。
為了研究二甲雙胍是否可以抑制人pscs的遷移能力，進(jìn)行了細(xì)胞遷移測定。與對照和1 μm二甲雙胍相比，10 μm二甲雙胍顯著抑制細(xì)胞遷移形成的圓形無細(xì)胞區(qū)的封閉（圖1 a、b）。這些結(jié)果在不同n期pdac患者的pscs中是可重復(fù)的（圖1 c、d）。此外，研究了mmp2的蛋白質(zhì)表達(dá)和酶活性。在不同n期pdac患者的pscs中，mmp2蛋白水平和酶活性在對照組和二甲雙胍組之間存在顯著差異（圖1 e、g）。二甲雙胍對cd10的蛋白質(zhì)表達(dá)具有抑制作用，cd10是一種促進(jìn)癌細(xì)胞進(jìn)展的基質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物（圖1 f）。這些數(shù)據(jù)表明，二甲雙胍可以抑制人類pscs的遷移能力和mmp2和cd10的表達(dá)水平。
圖1 二甲雙胍抑制 pscs 的遷移能力及其對 mmp2 和 cd10 的表達(dá)。
接下來，探討了轉(zhuǎn)化生長因子-β（tgf-β）信號通路（腫瘤遷移中的主要信號通路之一）在二甲雙胍降低pscs中mmp2表達(dá)的能力中所起的作用。為了確認(rèn)pscs，pdac類器官以及共培養(yǎng)的pscs和pdac類器官分泌tgf-β，將其培養(yǎng)48 h并檢測tgf-β的分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理組分泌的tgf-β少于對照組。然后，為了確定二甲雙胍是否影響tgf-β信號分子，在二甲雙胍存在下向pscs施用重組tgf-β，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍降低了mmp2、磷酸化smad 2/3和α-sma的表達(dá)，它們與轉(zhuǎn)移中的tgf-β信號傳導(dǎo)有關(guān)。在二甲雙胍處理的 pscs 中，給予重組 tgf-β 逆轉(zhuǎn)了 p-smad2/3、α-sma 和 mmp2 的衰減。此外進(jìn)行了遷移測定，以確定二甲雙胍的抗遷移作用是否獨立于ampk途徑，結(jié)果表明，二甲雙胍的抗遷移作用與ampk依賴性途徑無關(guān)，二甲雙胍是通過tgf-β而非ampk信號通路減弱pscs的遷移能力
為了研究二甲雙胍如何影響人pdac類器官，從術(shù)后組織中分離和培養(yǎng)了類器官，并觀察48小時（圖2 a），用ehtd-1和鈣黃綠素am染色以評估細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)對照組和二甲雙胍組沒有顯著差異（圖2 b）。細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖測定也未顯示差異（圖2 c）。然后研究了二甲雙胍是否會降低參與癌癥侵襲性相關(guān)的癌癥干細(xì)胞（csc）標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)癌癥干性標(biāo)志物lgr5、cd24、cd44、cd133和epcam的mrna轉(zhuǎn)錄本在n0期pdac類器官中顯著降低（圖2 d）。在 n1 和 n2 期 pdac 類器官中，lgr5 顯著降低（圖2 e、f）。在n0-n2期 pdac 類器官中，cd24、cd44和epcam降低（圖2 d-f）。此外，二甲雙胍處理顯著降低了csc標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平（圖2 g）。這些結(jié)果表明，二甲雙胍誘導(dǎo)pdac類器官中癌癥干性標(biāo)志物的下調(diào)，而不影響細(xì)胞活力或增殖。
圖2 二甲雙胍抑制pdac類器官腫瘤干性標(biāo)志物的表達(dá)。
進(jìn)一步地，為了概括人pdac基質(zhì)的腫瘤微環(huán)境，利用pdac類器官和pscs建立了體外3d直接共培養(yǎng)模型（圖3 a），pscs包圍了pdac類器官，而沒有干擾pdac類器官的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)（圖3 b）。然后比較了有和沒有二甲雙胍處理的癌癥干性因子的mrna轉(zhuǎn)錄水平。二甲雙胍在3d直接共培養(yǎng)模型中減弱了cd24、cd44、cd133和lgr5的基因和蛋白表達(dá)水平（圖3 c、d），這些發(fā)現(xiàn)在n1期和n2期pdac類器官和pscs中是一致的，表明pdac類器官和pscs的共同培養(yǎng)可以模擬人pdac基質(zhì)而不破壞導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，而且二甲雙胍可以作為輔助治療以減少癌癥干性因子。
圖3 在基質(zhì)膠中pdac類器官和pscs的體外3d直接共培養(yǎng)。
此外，使用間接共培養(yǎng)系統(tǒng)檢查了二甲雙胍對pdac 類器官和 pscs 中癌癥侵襲和遷移標(biāo)志物基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，二甲雙胍降低了上室pscs中mmp2和timp2的基因表達(dá)，以及下室pdac類器官中癌癥干性標(biāo)志物cd24、cd44、cd133和lgr5 的表達(dá)。
然后，研究了mmp2在二甲雙胍對pscs的抗遷移作用中的影響，使用間接共培養(yǎng)系統(tǒng)評估了向底部孔遷移的pscs數(shù)量（圖4 a）。為了探究mmp2下調(diào)在二甲雙胍抗遷移作用中的影響，分別用mmp2 sirna或?qū)φ誷irna轉(zhuǎn)染pscs，并使用間接3d共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行遷移測定。結(jié)果證實，用mmp2 sirna轉(zhuǎn)染可顯著降低pscs中mmp2的mrna表達(dá)（圖4 b）。然后研究mmp2沉默的pscs的遷移能力，發(fā)現(xiàn)mmp2沉默組向孔底遷移的pscs數(shù)量明顯少于對照組（圖4 c、d）。在對照和mmp2沉默組中，二甲雙胍處理顯示出與單獨使用mmp2沉默組相同的結(jié)果（圖4 c、d）。此外，為了探索mmp2是否可以促進(jìn)pscs的遷移和侵襲能力，在培養(yǎng)基中添加了rhmmp2。與對照組相比，rhmmp2處理導(dǎo)致更增強(qiáng)的遷移能力。在rhmmp2組中，二甲雙胍處理與對照組一樣減弱了增強(qiáng)的遷移（圖4 c、d）。這些結(jié)果表明，二甲雙胍通過靶向mmp2對pscs發(fā)揮抗遷移作用。
圖4 體外3d遷移模型中mmp2敲低對psc遷移能力的影響。
最后，研究了臨床相應(yīng)劑量的抗高血糖藥物二甲雙胍是否會影響裸鼠皮下植入pdac類器官的腫瘤生長，對異種移植小鼠以每天30 mg/kg口服二甲雙胍，持續(xù)28天，對照組注射無菌水。結(jié)果表明，二甲雙胍的給藥明顯減小了腫瘤體積。此外，二甲雙胍組的平均腫瘤重量明顯低于對照組，而且二甲雙胍組異種移植腫瘤的大小在視覺上小于對照組。二甲雙胍給藥28天后，癌癥干性和增殖標(biāo)志物，如cd24、cd44、cd133和ki67的mrna水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，二甲雙胍抑制pdac腫瘤異種移植物在體內(nèi)的生長。
總之，二甲雙胍的抗癌作用可在使用患者來源的pdac類器官和人原代pscs制成的pdac的3d直接和間接共培養(yǎng)模型中得到證實。此外，在異種移植模型中觀察到二甲雙胍的抗癌作用。該研究結(jié)果表明，二甲雙胍對pscs的抗遷移作用的關(guān)鍵機(jī)制是通過mmp2下調(diào)發(fā)生的，這與tgf-β信號的下調(diào)有關(guān)；二甲雙胍處理還可以減弱單獨培養(yǎng)或與 pscs 共培養(yǎng)的 pdac 類器官的癌癥干性。這種抗癌作用是可以通過使用與2型糖尿病患者相當(dāng)劑量的臨床相關(guān)的二甲雙胍濃度來實現(xiàn)的。
參考文獻(xiàn)：hahn s, oh bj, kim h, han iw, shin sh, kim g, jin sm, kim jh. anti-cancer effects of metformin in a 3d co-culture model of pancreatic ductal adenocarcinoma. am j cancer res. 2023 may 15;13(5):1806-1825. pmid: 37293149; pmcid: pmc10244103.
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