1 ，制備心肌細胞用出生一天的乳鼠最，好。
2，制備心肌細胞用試驗方法書上的方法，取心尖部用pps洗清，要剪粹0.1mm，注意器械無菌。
3，培養(yǎng)基有進口的dmem，用20%的胎牛血清，加雙抗，注意操作的無菌。
4，用分次消化法，在此37度的搖床中進行分次消化法，消化時間要把握好，不然大過，吹打要把握好。
5，消化好后直接接種于96孔板中進行試驗備用，離心的速度不能大快，否則心肌細胞就會有很多死細胞。
6，我用二次差速的方法來純化心肌細胞，每次1。5小時，差速后的細胞種在96孔板中并加上一定量的殺非心肌細胞的物質(zhì)，三天，經(jīng)研究加五天也行對細胞沒有很多影響。
7，心肌細胞有大部分的心肌纖維細胞和心肌細胞，而心肌細胞又分為m心肌細胞和f心肌細胞，我們用于研究用的心肌細胞最，好用m心肌細胞，因為m心肌細胞跳動很明顯。
心肌細胞培養(yǎng)方法詳述 配液：hanks液、低糖dmem液、高糖dmem液、胰，酶，消，化，液、雙抗液、碳，酸，氫，鈉液、鹽酸液。
取鼠：鼠盆用棉鋪好，取鼠。
準備：事先檢查顯微鏡、磁力攪拌器及離心機是否好用，提前三小時把胎牛血清、胰，酶、抗生素拿出來化開。其余未凍藥品也提前20分鐘拿出來緩和一下。新潔爾滅（0.1％）泡紗布（用10ml5％的新潔爾滅加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭臺面后把物品擺放好，開紫外線燈照30分鐘后開鼓風機吹至實驗結(jié)束。
物品：白大衣、飯盒
小剪子、小鑷子（4套）（一套剪皮膚、一套開胸取心，一套剔除心緣纖維組織，一套剪碎心臟）
瓶皿（2套）[兩個小圓培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內(nèi)加dmem液，先后裝取出的心和剔出纖維組織后的心] [一個小燒杯裝碘酒和酒精棉球]
250ml燒杯3個[一個用于水浴，事先加好水，最，好是一或二蒸] [一個裝0.1％新潔爾滅150ml左右，消毒小鼠]
500ml燒杯1個，用作廢液缸。
50ml燒杯3個（剪碎心肌組織，最后配液）
三角燒杯（50ml）+小轉(zhuǎn)子（小轉(zhuǎn)子，酒精擦，雙蒸水沖后，再把酒精*沖掉后用三角燒杯高壓）
離心管及帽（12-14個），兩個試管
吸管 （5~8個）大鑷子 （兩把，持物，例夾棉球等）
臺面：磁力攪拌器、紗布（事先用于托盤裝0.1％新潔爾滅浸泡）、試管架、泡沫塑料板、五個針頭（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消，毒，棉，球，泡酒精、碘酒）大鑷子兩把（一把夾棉球，一把取鼠）、3個250ml燒瓶（一個裝一蒸水，一個裝新潔爾滅，另一為空的備用）1個500ml燒瓶（廢液缸）、溫度計、ph試紙（事先調(diào)ph值）、酒精燈、打火機/火柴、載玻片（5-10個）[用于培養(yǎng)前看接種密度及消化后看細胞密度]、注射器5ml 6個（胰，酶、dmem、胎牛血清）1ml 2個（雙抗液）20ml備用 2個、微量加樣器 1000ml及500ml
以上物品均用紫外線照30分鐘。
另外準備手套、帽子、口罩、24孔培養(yǎng)板、離心機+一把小鎖、未凍藥品及dmem、nahco3、胎牛血清。
事先把顯微鏡、離心機、磁力攪拌器電源插好。檢查酒精燈是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否夠用。先把物品遞入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精燈打開，把瓶皿擺好，再用一個瓶皿裝酒精棉球。
培養(yǎng)過程：
1. 把兩個5ml注射器分別插入dmem和胰，酶中，分別向兩個圓皿中加入5ml的dmem培養(yǎng)液。用一把大鑷子從鼠盆里取出一只生后2~3天的sd大鼠，放入0.1％新潔爾滅浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定（位置擺正），用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開皮，充分撕拉開，再用酒精棉球消毒，后換另一把小剪子和鑷子在劍突處正中線稍偏左開胸取心。
2. 取出的心放在剛才準備的一個裝有dmem的圓皿中再取下一只。重復(fù)以上過程。（鼠全部殺死后，把取鼠鑷及泡沫板、新潔爾滅缸等拿**面。消毒、清潔，鋪紗布、換手套。
3．用第三副剪子和鑷子把圓皿中的心臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個預(yù)先裝好dmem的圓皿中。抽取5ml的胰，酶，然后將其中少許放入50ml的小燒杯中，大部分倒入三角燒瓶中。用第四副剪子將燒杯中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入三角燒瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰，酶刷凈燒杯。
4．把溫度計和三角燒杯放入250ml燒瓶中，（事先調(diào)好水量，多會沒過三角燒杯，少溫度會不均勻）。打開磁力攪拌器電源，調(diào)溫度（使-緩慢加到34~35℃）和轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)速不可過快，否則會打碎細胞，基本上標志為平行）。一定要注意監(jiān)控。
5．溫度達到34℃時開始計時，第，一次為10分鐘，以后可為8分鐘，事情況而定。在此期間，在試管架上擺上5、6個離心管，標上1、1，2、2。其中在1號兩管事先加入dmem液各2毫升
6．10分鐘后，把三角燒瓶取下，磁力攪拌器關(guān)上，用一個吸管輕輕吹打（使消化下來的細胞*從組織團快上掉下來），這個吸管（1）用后固定放在一個離心管中，以后每次消化后取下都用其吹打幾下，第，一次上清棄去，然后向兩個1號管分別倒入2ml上清（盡量不要把組織倒出，也不要剩液太多，以免消化下的細胞重復(fù)消化造成損傷），用另一個吸管（2）混勻配平兩個管（即兩個管水平高度相同），輕輕吹打，以免損壞細胞。
7．接著把這兩個離心管放入離心機中，調(diào)10分鐘，800或1000轉(zhuǎn)，墊小鎖，打開關(guān)。
8．同時向三角燒瓶中加入5ml胰，酶，繼續(xù)消化8分鐘，注意控制溫度。此時向兩個2號管中分別加入2mldmem液。
9．取下三角燒瓶，仍用1號吸管吹打，后靜置片刻向兩個2號管分別倒入2毫升的上清，取出兩個離心后的1號管，把上清液沿細胞貼壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的dmem液，用2號吸管取少量液體加入另一個離心管中，把管底的沉淀細胞洗下來，把液體全部移入其中一管，三個管（1個1號管，兩個2號管）配平，放入離心管中，離心十分鐘。同時仍加5ml的胰，酶，放入三角燒瓶中，繼續(xù)消化（注意控制溫度，達34℃時計時）。
10．消化到4次左右，吹打均勻后，吸一滴滴在載玻片上，拿到鏡下觀察消化情況，決定消化次數(shù)。
11．離心2次的吸管，放在試管架上，待離心過程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精確，大致這樣）dmem液，記住共加入多少dmem液的量，換吸管（3號）把各管底細胞塊吸下吹打均勻后，移入50ml燒杯中，然后用注射器抽取余量的dmem加入燒杯中，加入小牛血清及抗生素，換吸管（4號）吹打均勻。
12．取出24孔培養(yǎng)板，一個人吹打，另一個人用加樣器加藥。封蓋時過火，蓋上蓋，放在co2孵箱。24小時后觀察是否貼壁。
（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液時每孔加1~1.5ml）
配藥 ：
天平、量筒、燒杯、玻璃棒、二蒸水、硫酸紙。
ne：加樣器 1000μl 大頭一個或1ml注射器一個，50μl小頭一個。量筒100ml，燒杯100毫升。
配法：抽取0.85mlne液，放入燒杯，再加二蒸水99.15ml補足至100ml，備用。在工作臺內(nèi)，用針頭濾器濾過（儀器：針頭濾器及膜，先試膜，再高壓消毒，注意壓力），在一個新的100ml燒杯內(nèi)。取4個50ml的燒杯，分別標號1、2、3、4。然后用加樣器（100μl）分別取0.1mlne放入3、4杯內(nèi)。
小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml（用低糖dmem配，0.4ml牛血清需500μl加樣器一個）。配成后即為4％的濃度。分別取0.1ml放入1、2、3、4號的 50ml的燒杯內(nèi)。
抗生素：分別取0.1ml放入1、2、3、4號的 50ml的燒杯內(nèi)。
分別向1、2、3、4號的 50ml的燒杯內(nèi)加入dmem。各為9.7ml、9.7ml、9.6ml、9.6ml。用4個吸管吹打均勻，然后用加樣器每組加1.0ml。另一人用吸管吸出培養(yǎng)液。每組換一個大頭。