1 ，制備心肌細(xì)胞用出生一天的乳鼠最，好。
2，制備心肌細(xì)胞用試驗(yàn)方法書(shū)上的方法，取心尖部用pps洗清，要剪粹0.1mm，注意器械無(wú)菌。
3，培養(yǎng)基有進(jìn)口的dmem，用20%的胎牛血清，加雙抗，注意操作的無(wú)菌。
4，用分次消化法，在此37度的搖床中進(jìn)行分次消化法，消化時(shí)間要把握好，不然大過(guò)，吹打要把握好。
5，消化好后直接接種于96孔板中進(jìn)行試驗(yàn)備用，離心的速度不能大快，否則心肌細(xì)胞就會(huì)有很多死細(xì)胞。
6，我用二次差速的方法來(lái)純化心肌細(xì)胞，每次1。5小時(shí)，差速后的細(xì)胞種在96孔板中并加上一定量的殺非心肌細(xì)胞的物質(zhì)，三天，經(jīng)研究加五天也行對(duì)細(xì)胞沒(méi)有很多影響。
7，心肌細(xì)胞有大部分的心肌纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞，而心肌細(xì)胞又分為m心肌細(xì)胞和f心肌細(xì)胞，我們用于研究用的心肌細(xì)胞最，好用m心肌細(xì)胞，因?yàn)閙心肌細(xì)胞跳動(dòng)很明顯。
心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法詳述 配液：hanks液、低糖dmem液、高糖dmem液、胰，酶，消，化，液、雙抗液、碳，酸，氫，鈉液、鹽酸液。
取鼠：鼠盆用棉鋪好，取鼠。
準(zhǔn)備：事先檢查顯微鏡、磁力攪拌器及離心機(jī)是否好用，提前三小時(shí)把胎牛血清、胰，酶、抗生素拿出來(lái)化開(kāi)。其余未凍藥品也提前20分鐘拿出來(lái)緩和一下。新潔爾滅（0.1％）泡紗布（用10ml5％的新潔爾滅加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭臺(tái)面后把物品擺放好，開(kāi)紫外線(xiàn)燈照30分鐘后開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)吹至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
物品：白大衣、飯盒
小剪子、小鑷子（4套）（一套剪皮膚、一套開(kāi)胸取心，一套剔除心緣纖維組織，一套剪碎心臟）
瓶皿（2套）[兩個(gè)小圓培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿內(nèi)加dmem液，先后裝取出的心和剔出纖維組織后的心] [一個(gè)小燒杯裝碘酒和酒精棉球]
250ml燒杯3個(gè)[一個(gè)用于水浴，事先加好水，最，好是一或二蒸] [一個(gè)裝0.1％新潔爾滅150ml左右，消毒小鼠]
500ml燒杯1個(gè)，用作廢液缸。
50ml燒杯3個(gè)（剪碎心肌組織，最后配液）
三角燒杯（50ml）+小轉(zhuǎn)子（小轉(zhuǎn)子，酒精擦，雙蒸水沖后，再把酒精*沖掉后用三角燒杯高壓）
離心管及帽（12-14個(gè)），兩個(gè)試管
吸管 （5~8個(gè)）大鑷子 （兩把，持物，例夾棉球等）
臺(tái)面：磁力攪拌器、紗布（事先用于托盤(pán)裝0.1％新潔爾滅浸泡）、試管架、泡沫塑料板、五個(gè)針頭（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消，毒，棉，球，泡酒精、碘酒）大鑷子兩把（一把夾棉球，一把取鼠）、3個(gè)250ml燒瓶（一個(gè)裝一蒸水，一個(gè)裝新潔爾滅，另一為空的備用）1個(gè)500ml燒瓶（廢液缸）、溫度計(jì)、ph試紙（事先調(diào)ph值）、酒精燈、打火機(jī)/火柴、載玻片（5-10個(gè)）[用于培養(yǎng)前看接種密度及消化后看細(xì)胞密度]、注射器5ml 6個(gè)（胰，酶、dmem、胎牛血清）1ml 2個(gè)（雙抗液）20ml備用 2個(gè)、微量加樣器 1000ml及500ml
以上物品均用紫外線(xiàn)照30分鐘。
另外準(zhǔn)備手套、帽子、口罩、24孔培養(yǎng)板、離心機(jī)+一把小鎖、未凍藥品及dmem、nahco3、胎牛血清。
事先把顯微鏡、離心機(jī)、磁力攪拌器電源插好。檢查酒精燈是否有酒精，碘酒和酒精棉球是否夠用。先把物品遞入，后穿大衣、帽子和口罩。然后把酒精燈打開(kāi)，把瓶皿擺好，再用一個(gè)瓶皿裝酒精棉球。
培養(yǎng)過(guò)程：
1. 把兩個(gè)5ml注射器分別插入dmem和胰，酶中，分別向兩個(gè)圓皿中加入5ml的dmem培養(yǎng)液。用一把大鑷子從鼠盆里取出一只生后2~3天的sd大鼠，放入0.1％新潔爾滅浸泡一下后拿出放在泡沫板上，用針頭把鼠固定（位置擺正），用另一把大鑷子取碘酒棉球擦皮膚，再用酒精棉球脫碘，取一把小剪子及小鑷子開(kāi)皮，充分撕拉開(kāi)，再用酒精棉球消毒，后換另一把小剪子和鑷子在劍突處正中線(xiàn)稍偏左開(kāi)胸取心。
2. 取出的心放在剛才準(zhǔn)備的一個(gè)裝有dmem的圓皿中再取下一只。重復(fù)以上過(guò)程。（鼠全部殺死后，把取鼠鑷及泡沫板、新潔爾滅缸等拿**面。消毒、清潔，鋪紗布、換手套。
3．用第三副剪子和鑷子把圓皿中的心臟周邊的血凝及纖維組織剔除掉，放在另一個(gè)預(yù)先裝好dmem的圓皿中。抽取5ml的胰，酶，然后將其中少許放入50ml的小燒杯中，大部分倒入三角燒瓶中。用第四副剪子將燒杯中的心臟剪成1mm3的碎塊，倒入三角燒瓶中（可用剪刀刮入），再用剩余胰，酶刷凈燒杯。
4．把溫度計(jì)和三角燒杯放入250ml燒瓶中，（事先調(diào)好水量，多會(huì)沒(méi)過(guò)三角燒杯，少溫度會(huì)不均勻）。打開(kāi)磁力攪拌器電源，調(diào)溫度（使-緩慢加到34~35℃）和轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)速不可過(guò)快，否則會(huì)打碎細(xì)胞，基本上標(biāo)志為平行）。一定要注意監(jiān)控。
5．溫度達(dá)到34℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，第，一次為10分鐘，以后可為8分鐘，事情況而定。在此期間，在試管架上擺上5、6個(gè)離心管，標(biāo)上1、1，2、2。其中在1號(hào)兩管事先加入dmem液各2毫升
6．10分鐘后，把三角燒瓶取下，磁力攪拌器關(guān)上，用一個(gè)吸管輕輕吹打（使消化下來(lái)的細(xì)胞*從組織團(tuán)快上掉下來(lái)），這個(gè)吸管（1）用后固定放在一個(gè)離心管中，以后每次消化后取下都用其吹打幾下，第，一次上清棄去，然后向兩個(gè)1號(hào)管分別倒入2ml上清（盡量不要把組織倒出，也不要剩液太多，以免消化下的細(xì)胞重復(fù)消化造成損傷），用另一個(gè)吸管（2）混勻配平兩個(gè)管（即兩個(gè)管水平高度相同），輕輕吹打，以免損壞細(xì)胞。
7．接著把這兩個(gè)離心管放入離心機(jī)中，調(diào)10分鐘，800或1000轉(zhuǎn)，墊小鎖，打開(kāi)關(guān)。
8．同時(shí)向三角燒瓶中加入5ml胰，酶，繼續(xù)消化8分鐘，注意控制溫度。此時(shí)向兩個(gè)2號(hào)管中分別加入2mldmem液。
9．取下三角燒瓶，仍用1號(hào)吸管吹打，后靜置片刻向兩個(gè)2號(hào)管分別倒入2毫升的上清，取出兩個(gè)離心后的1號(hào)管，把上清液沿細(xì)胞貼壁一方慢慢倒掉，后向其中一管加入4ml的dmem液，用2號(hào)吸管取少量液體加入另一個(gè)離心管中，把管底的沉淀細(xì)胞洗下來(lái)，把液體全部移入其中一管，三個(gè)管（1個(gè)1號(hào)管，兩個(gè)2號(hào)管）配平，放入離心管中，離心十分鐘。同時(shí)仍加5ml的胰，酶，放入三角燒瓶中，繼續(xù)消化（注意控制溫度，達(dá)34℃時(shí)計(jì)時(shí)）。
10．消化到4次左右，吹打均勻后，吸一滴滴在載玻片上，拿到鏡下觀(guān)察消化情況，決定消化次數(shù)。
11．離心2次的吸管，放在試管架上，待離心過(guò)程全部完事后，把各管上清液倒掉，在各管加上3ml（不用精確，大致這樣）dmem液，記住共加入多少dmem液的量，換吸管（3號(hào)）把各管底細(xì)胞塊吸下吹打均勻后，移入50ml燒杯中，然后用注射器抽取余量的dmem加入燒杯中，加入小牛血清及抗生素，換吸管（4號(hào)）吹打均勻。
12．取出24孔培養(yǎng)板，一個(gè)人吹打，另一個(gè)人用加樣器加藥。封蓋時(shí)過(guò)火，蓋上蓋，放在co2孵箱。24小時(shí)后觀(guān)察是否貼壁。
（24孔板，每孔最多加2ml，一般加液時(shí)每孔加1~1.5ml）
配藥 ：
天平、量筒、燒杯、玻璃棒、二蒸水、硫酸紙。
ne：加樣器 1000μl 大頭一個(gè)或1ml注射器一個(gè)，50μl小頭一個(gè)。量筒100ml，燒杯100毫升。
配法：抽取0.85mlne液，放入燒杯，再加二蒸水99.15ml補(bǔ)足至100ml，備用。在工作臺(tái)內(nèi)，用針頭濾器濾過(guò)（儀器：針頭濾器及膜，先試膜，再高壓消毒，注意壓力），在一個(gè)新的100ml燒杯內(nèi)。取4個(gè)50ml的燒杯，分別標(biāo)號(hào)1、2、3、4。然后用加樣器（100μl）分別取0.1mlne放入3、4杯內(nèi)。
小牛血清：先配初液，即0.4ml/10ml（用低糖dmem配，0.4ml牛血清需500μl加樣器一個(gè)）。配成后即為4％的濃度。分別取0.1ml放入1、2、3、4號(hào)的 50ml的燒杯內(nèi)。
抗生素：分別取0.1ml放入1、2、3、4號(hào)的 50ml的燒杯內(nèi)。
分別向1、2、3、4號(hào)的 50ml的燒杯內(nèi)加入dmem。各為9.7ml、9.7ml、9.6ml、9.6ml。用4個(gè)吸管吹打均勻，然后用加樣器每組加1.0ml。另一人用吸管吸出培養(yǎng)液。每組換一個(gè)大頭。