生物制品是指以微生物、細(xì)胞、動(dòng)物或人源組織和體液等為起始原材料，用生物學(xué)技術(shù)制備，用于預(yù)防、治療和診斷人類疾病的制劑。當(dāng)前，隨著越來越多的生物制品進(jìn)入治療領(lǐng)域，于是生物制品與之俱來的生物安全性問題被漸漸提上日程，生物制品的質(zhì)量控制也日趨嚴(yán)格。其中宿主細(xì)胞殘留核酸由于可能會(huì)傳遞腫瘤或病毒相關(guān)基因，存在潛在致癌性和感染性風(fēng)險(xiǎn)。各國(guó)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)對(duì)生物制品中宿主細(xì)胞殘留核酸的態(tài)度謹(jǐn)慎且明確，要求各制藥企業(yè)建立詳細(xì)可行、靈敏度高的檢測(cè)方法，用于驗(yàn)證藥品的純化過程可以去除殘留dna，并對(duì)終產(chǎn)品的放行嚴(yán)格把關(guān)，避免攜帶外源dna的藥品流入市場(chǎng)。
宿主細(xì)胞殘留dna標(biāo)準(zhǔn)
各國(guó)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)均對(duì)生物制品中宿主細(xì)胞dna的殘留量進(jìn)行了嚴(yán)格的限度控制以規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)。
表1 宿主細(xì)胞殘留dna標(biāo)準(zhǔn)
藥典 標(biāo)準(zhǔn)
中國(guó)藥典2020版 以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑dna殘留量不能超過100 pg/劑；
以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗，其宿主dna殘留量應(yīng)≤10 ng/劑。
who 推薦非腸道接種成品中殘留dna不高于10 ng/劑；
口服類成品中殘留dna不高于100ug/劑。
fda 生物制品宿主細(xì)胞dna殘余限度為100 pg/劑；
對(duì)于大劑量生物制品如單克隆抗體，根據(jù)其殘留dna來源及給藥途徑不同，dna殘留量可放寬至10 ng/劑；
對(duì)于選用連續(xù)非致瘤性細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品成品，其dna殘留量應(yīng)控制在10 ng/劑以下，長(zhǎng)度不大于200 bp。
歐洲藥典 規(guī)定生物制品殘留dna限度不超過10 ng/劑
除了對(duì)宿主核酸殘留量有限度規(guī)定，我國(guó)shou次對(duì)于dna殘留片段的大小也有了明文規(guī)定：2022年，我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中提到對(duì)于生產(chǎn)若使用了腫瘤細(xì)胞系致瘤細(xì)胞系或攜帶有致瘤基因、病毒來源序列的細(xì)胞（如hek 293t細(xì)胞），在確保無完整活細(xì)胞殘留的同時(shí)，需對(duì)dna的殘留量和殘留片段大小進(jìn)行控制。建議盡量將殘留dna控制在10ng/劑以內(nèi)，dna殘留片段的大小控制在200bp以下。
表2宿主細(xì)胞殘留dna片段風(fēng)險(xiǎn)因子
宿主細(xì)胞殘留dna片段大小（bp） 風(fēng)險(xiǎn)因子
＜200 1
200-1000 2
＞1000 3
＞1000 4
注：片段越長(zhǎng)，風(fēng)險(xiǎn)因子越大。
宿主細(xì)胞殘留dna檢測(cè)方法
為確保生物制品的安全性和質(zhì)量，因此建立合適的宿主細(xì)胞殘留dna檢測(cè)方法至關(guān)重要?！吨袊?guó)藥典2020年版》通則3407中推薦了三種外源性dna殘留量測(cè)定方法，包括dna探針雜交法、熒光染色法和定量pcr法。
表3 宿主細(xì)胞殘留dna檢測(cè)方法
方法學(xué) dna探針雜交法 熒光染色法 定量pcr法
檢測(cè)原理 將特異性單鏈dna探針標(biāo)記后與供試品單鏈dna雜交，并使用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性dna對(duì)照比對(duì)后，根據(jù)顯色的深淺判斷供試品中外源性dna殘留量。 應(yīng)用雙鏈dna熒光染料與雙鏈dna特異性結(jié)合形成復(fù)合物在波長(zhǎng)480nm激發(fā)產(chǎn)生熒光型號(hào)，根據(jù)供試品的熒光強(qiáng)度，計(jì)算供試品中dna的殘留量。 pcr反應(yīng)過程中可通過熒光標(biāo)記的特異性探針或熒光染料摻入而檢測(cè)pcr產(chǎn)物量。在反應(yīng)過程中釋放的熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí),體系的pcr環(huán)數(shù)(ct)與起始dna板量的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系。采用已知濃度的dna標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)特定模板進(jìn)行定量分析,測(cè)定供試品中的外源dna殘留量。
特異性 中 低 高
靈敏度 10fg/ul 1pg/ul 1fg/ul
檢測(cè)時(shí)長(zhǎng) 5-6h 0.5-1h 1-1.5h
檢測(cè)范圍 0.01-100pg/ul 1.25-80pg/ul 0.01-100pg/ul
其中定量pcr法因其檢測(cè)特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好、通量高、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)已成為生物制品工藝研究和產(chǎn)品質(zhì)量控制的shou選檢測(cè)方法。愛必信最終選擇更準(zhǔn)確、可靠、科學(xué)的熒光探針（taqman®）qpcr 法作為細(xì)胞殘留dna檢測(cè)的方法。推出了一系列宿主細(xì)胞殘留核酸定量檢測(cè)試劑盒，能夠?qū)Ｒ豢焖俚膶?duì)中控樣品或原液成品中宿主細(xì)胞殘留核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，靈敏、準(zhǔn)確和定量下限，能滿足病毒疫苗生產(chǎn)、重組蛋白藥物純化、細(xì)胞治療和疫苗研究中緩解pbmc細(xì)胞結(jié)團(tuán)以及慢病毒的大規(guī)模純化等工業(yè)客戶的工藝研究和質(zhì)控需求。
圖1 熒光探針（taqman®）qpcr法
宿主細(xì)胞殘留dna檢測(cè)流程
宿主細(xì)胞殘留dna檢測(cè)流程主要包含宿主細(xì)胞殘留dna提取（磁珠法）和宿主細(xì)胞殘留dna定量檢測(cè)（熒光探針（taqman®）qpcr法）。
圖2 宿主細(xì)胞殘留dna檢測(cè)流程
宿主細(xì)胞殘留核酸提取
宿主細(xì)胞殘留dna（磁珠法）樣本前處理試劑盒（abs60544）用于生物制品樣本前處理，精準(zhǔn)抽提各種生物制品中宿主細(xì)胞殘留dna。搭配宿主殘留dna/dna片段檢測(cè)試劑盒使用。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：
適用于e.coli、hek293、vero、cho等多種宿主dna樣本
靈敏度高
通用性強(qiáng)
靈敏度可達(dá)0.03pg/ul，回收率可達(dá)70-130%，符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)
可手動(dòng)提取、可配合全自動(dòng)核酸提取儀自動(dòng)化提取，滿足高通量
適用性強(qiáng)
操作便捷
消化時(shí)間僅15min，配合核酸提取儀1h內(nèi)完成整個(gè)提取過程
產(chǎn)品信息
樣本核酸提取
貨號(hào) 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
abs60544 宿主細(xì)胞殘留dna（磁珠法）樣本前處理試劑盒 100t
宿主細(xì)胞殘留核酸/dna片段檢測(cè)
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：
快速便捷：方便操作，1小時(shí)出結(jié)果。
穩(wěn)定性高：受環(huán)境影響較小，保質(zhì)期內(nèi)性能穩(wěn)定
精密度高：各濃度檢測(cè)值cv<15%
專一性強(qiáng)：考察生物制品生產(chǎn)中常用的dna對(duì)檢測(cè)試劑盒的干擾，干擾組應(yīng)與對(duì)照組重合，未見干擾。
產(chǎn)品信息：
宿主細(xì)胞殘留核酸檢測(cè)
貨號(hào) 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
abs60543 質(zhì)粒dna殘留(qpcr)檢測(cè)試劑盒 100t
abs60545 hek293殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60546 293t細(xì)胞殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60547 human殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60548 hela細(xì)胞殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60549 e1a殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60550 e1a&sv40lta殘留dna(qpcr)檢測(cè)試劑盒 100t
abs60551 e.coli殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60552 e.coli總rna殘留（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60553 cho殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60554 vero殘留 dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60555 畢赤酵母殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
abs60556 pg13殘留dna（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t
宿主細(xì)胞殘留dna片段分析
貨號(hào) 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
abs60557 hek293殘留dna片段（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t×4
abs60558 293t細(xì)胞殘留dna片段（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t×4
abs60559 human殘留dna片段（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t×4
abs60560 hela細(xì)胞殘留dna片段（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t×4
abs60561 vero 殘留 dna 片段（qpcr）檢測(cè)試劑盒 100t×4
參考文獻(xiàn)：
[1] state administration for market regulation. administrative measures for the batch release of biological products[s].2020-12-11
[2]《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心，2022年5月
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