2020年，jennifer doudna教授和emmanuelle charpentier博士所發(fā)現(xiàn)的crispr-cas9“基因剪刀”被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。隨后，crispr-cas技術(shù)得到快速發(fā)展，在很短的時(shí)間內(nèi)完成了由基礎(chǔ)理論到初步科學(xué)驗(yàn)證，進(jìn)入到多種不同的應(yīng)用領(lǐng)域。
在ivd領(lǐng)域，基于crispr-cas為基礎(chǔ)所開(kāi)發(fā)的新興診斷被用于傳染病和癌癥監(jiān)測(cè)中，并以其快速、便攜、經(jīng)濟(jì)、高效等特點(diǎn)為分子檢測(cè)帶來(lái)革新。讓我們一起來(lái)總結(jié)crispr技術(shù)中的幾位大主角，cas9、cas12、cas13、cas14蛋白所延伸的分子診斷技術(shù)。為行業(yè)內(nèi)的學(xué)者、科研人員和工作者帶來(lái)一些啟發(fā)。如何選擇自己實(shí)驗(yàn)中合適的cas蛋白酶本文將要闡述下幾種酶的區(qū)別。
cas9蛋白
cas9是一種dna內(nèi)切酶，cas9內(nèi)切酶必須在向?qū)na分子的引導(dǎo)下對(duì)dna進(jìn)行切割，這是因?yàn)檫@些向?qū)na分子含有與靶dna序列互補(bǔ)的序列，稱(chēng)之為pam序列。cas9蛋白精確的平端切割位點(diǎn)位于pam上游3個(gè)核苷酸位置，形成平末端產(chǎn)物。cas9蛋白的hnh結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crrna互補(bǔ)配對(duì)的那一條dna鏈，而ruvc結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另外一條非互補(bǔ)dna鏈。最終在cas9的作用下dna雙鏈斷裂（dsb）形成雙鏈dna缺口，然后細(xì)胞會(huì)借助同源重組機(jī)制(homologous recombination)或者非同源末端連接機(jī)制(non-homologous end joining)對(duì)斷裂的dna進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)dna片段的敲除或敲入。
cas9的應(yīng)用：
cas9含有兩個(gè)具有切割活性的結(jié)構(gòu)域：hnh結(jié)構(gòu)域和ruvc結(jié)構(gòu)域，其中hnh結(jié)構(gòu)域切割與crrna互補(bǔ)的dna鏈，而ruvc結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈。ruvc結(jié)構(gòu)域可分為三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域：ruvc i、ruvc ii和ruvc iii，ruvc i接近于cas9的氨基端，ruvc ii和ruvc iii位于hnh結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)。僅對(duì)cas9中的ruvc i進(jìn)行突變，具體而言就是讓ruvc i的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基中的一個(gè)轉(zhuǎn)換成（d10a或h840a），從而得到cas9切口酶（cas9 nickase, cas9n）。這種切口酶不能切割非互補(bǔ)dna鏈，僅能切割與crrna互補(bǔ)的dna鏈，能夠明顯減少脫靶效應(yīng)，同時(shí)保持高效的基因修飾。
通過(guò)點(diǎn)突變的方式使cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域ruvc-和hnh-失去活性，其中ruvc催化結(jié)構(gòu)域的第10位天冬氨酸突變?yōu)椋╠10a）以及hnh催化結(jié)構(gòu)域的第840位突變?yōu)椋╤840a），cas9蛋白將失去核酸內(nèi)切酶活性，形成的dcas9只能在sgrna的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因，而不具備剪切dna的功能。因此，將dcas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始，從而抑制基因表達(dá)；將dcas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活。因此dcas9與cas9、cas9 nickase的不同之處在于，dcas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會(huì)對(duì)基因組dna造成不可逆轉(zhuǎn)的改變。
cas12蛋白
crispr–cas12a蛋白，以前稱(chēng)為cpf1，是一種內(nèi)切核酸酶，可以通過(guò)向?qū)na進(jìn)行編程，以靶向互補(bǔ)的dna序列。在與靶dna結(jié)合后，crisprcas12a蛋白在每條靶dna鏈中誘導(dǎo)切割，產(chǎn)生雙鏈dna斷裂。除了誘導(dǎo)靶dna的順式切割之外，靶dna結(jié)合還誘導(dǎo)非靶dna的反式切割。因此，crispr cas12a-rna向?qū)?fù)合物可以提供針對(duì)入侵核酸（例如噬菌體和質(zhì)粒）的序列特異性免疫。類(lèi)似于crispr/cas9，cas12a已被重新用作原核和真核細(xì)胞中可編程基因組編輯和轉(zhuǎn)錄控制的遺傳工具。此外，其反式切割活性已應(yīng)用于高靈敏度核酸檢測(cè)。crispr/cas12a系統(tǒng)的脫靶率將比cas9低得多，并且因?yàn)樗ccas9的諸多不同，它將能與crispr/cas9互補(bǔ)，從而擴(kuò)大crispr/cas系統(tǒng)的工具箱，使基于crispr/cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)具有更強(qiáng)的普適性和編輯能力。
cas12b核酸酶（又名c2c1）是依賴(lài)于rna介導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶，在靶標(biāo)dna存在pam的情況下，可特異地切割靶標(biāo)雙鏈dna。cas12b蛋白比cas9和cas12a更小，且來(lái)源于嗜酸耐熱菌且切割活性較高的alicyclobacillus acidoterrestris。cas12b的最佳切割反應(yīng)溫度為48℃。和同家族的cas12a類(lèi)似，cas12b也識(shí)別5'-ttn的pam序列，切割dna后也產(chǎn)生粘性末端；然而，cas12b是雙rna導(dǎo)向，依賴(lài)于crrna和tracrrna（或連接后形成的sgrna）。此外，cas12b不僅可以應(yīng)用于靶標(biāo)dsdna的切割，還可以用于靶標(biāo)核酸的快速檢測(cè)，詳見(jiàn)holmesv2核酸快檢技術(shù)。
cas13蛋白
cas13蛋白可進(jìn)一步分為4個(gè)亞型，即crispr-cas13a,b,c,d。除了cas13c的相關(guān)研究目前還不充分外，另外3中cas蛋白已經(jīng)有了比較廣泛的研究和應(yīng)用。
cas13a核酸酶（又名c2c2）是依賴(lài)于rna介導(dǎo)的rna內(nèi)切核酸酶。在靶標(biāo)單鏈rna存在pfs序 列的情況下，可特異地切割靶標(biāo)rna。此外，cas13a還具有依賴(lài)于靶標(biāo)單鏈rna的反式切割活性，可用于開(kāi)發(fā)靶標(biāo)核酸的快速檢測(cè)試劑盒。例如，mit的張鋒團(tuán)隊(duì)便利用cas13a蛋白開(kāi)發(fā)了名為“sherlock”的下一代分子診斷系統(tǒng)。對(duì)于細(xì)菌而言，cas13a這種反式切割活性是有意義的。若細(xì)菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細(xì)胞死亡或休眠狀態(tài)，以限制感染在整個(gè)群體中的傳播。像cas13a一樣，cas13b僅需要單個(gè)向?qū)na就能靶向目的序列，此外，cas13b能夠同時(shí)靶向多個(gè)rna轉(zhuǎn)錄本。
而此后發(fā)現(xiàn)的cas13d，具有更高的效率、更低的脫靶率，更重要的是，cas13d相比其他cas13家族成員具有更小的尺寸，能夠更容易包裝到病毒載體中，因此具有更好的遞送優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。
cas14蛋白
除了上述幾種具有靶向切割能力的cas蛋白之外，近期發(fā)現(xiàn)的cas14也具有類(lèi)似的功能。
cas14a核酸酶是一種內(nèi)切核酸酶，其在tracrrna:crrna（或sgrna）的引導(dǎo)下，特異結(jié)合并切割靶標(biāo)ssdna，且無(wú)需pam位點(diǎn)。相比于其他的cas蛋白，cas14蛋白的分子量普遍較?。?00-700aa）；與cas12類(lèi)似，cas14a也可以結(jié)合靶標(biāo)核酸并激活其ssdna反式切割活性。研究人員認(rèn)為，cas14的切割對(duì)象是單鏈dna，而不是雙鏈dna，因此未必是良好的基因組編輯工具。不過(guò)，他們認(rèn)為cas14可用在detectr診斷工具中。
相關(guān)產(chǎn)品：
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關(guān)鍵詞：快速檢測(cè)試劑