一、骨髓瘤細(xì)胞系的選擇
骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量mcab。用于融合試驗(yàn)的主要骨髓瘤細(xì)胞系有p3/x63-ag8（x63）、p3/x63-ag8.653（x63-ag8.653）、p3/nsi-1-ag4-1（ns-1）、p3/x63-ag8.ul（p3ul）、sp2/0-ag14（sp2/0）、f0、s194/5.xxo.bu.1、mpc11-45.6tg1.7、210.rcy3.ag1.2.3、gm15006tg-a12及u-266ar等。
骨髓瘤細(xì)胞可用一般的培養(yǎng)液，如rpmi1640，dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細(xì)胞濃度以104～5×105/ml為宜，zui大濃度不得超過(guò)106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細(xì)胞在傳代過(guò)程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用8-氮*進(jìn)行處理，使生存的細(xì)胞對(duì)hat呈均一的敏感性。
在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它活細(xì)胞，則可促進(jìn)這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，所加入的這種細(xì)胞被稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在制備mcab的過(guò)程中，許多環(huán)節(jié)均需要加飼養(yǎng)細(xì)胞，如在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3t3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞的量一般為2×104或105細(xì)胞/孔。
二、細(xì)胞融合的步驟
細(xì)胞融合一般包括制備飼養(yǎng)細(xì)胞層、制備免疫脾細(xì)胞、制備骨髓瘤細(xì)胞及融合等四個(gè)步驟。
制備飼養(yǎng)細(xì)胞層時(shí)一般選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用balb/c小鼠，6～10周后拉頸處死；浸泡在75%酒精內(nèi)，3～5min后用無(wú)菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，用*注入5～6ml預(yù)冷的培養(yǎng)液（嚴(yán)禁刺破腸管），反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200rpm分離5～6min后，用20%小牛血清（ncs）或胎牛血清（fcs）的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/ml，進(jìn)行培養(yǎng)。
制備免疫脾細(xì)胞時(shí)先將zui后一次加強(qiáng)免疫3天后小鼠拉頸處死，無(wú)菌取脾臟，培養(yǎng)液洗一次后，將脾臟研碎，過(guò)不銹鋼篩網(wǎng)后離心，細(xì)胞用培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)后取108脾淋巴細(xì)胞懸液備用。
制備骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞離心，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2次，計(jì)數(shù)后取1×107細(xì)胞備用
融合時(shí)先將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無(wú)血清不*培養(yǎng)液洗1次，離心后棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（peg）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。在90s內(nèi)加入37℃預(yù)溫的1ml45%peg（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動(dòng)。37℃水浴作用90s。每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml的不*培養(yǎng)液以終止peg作用。離心棄上清，用含20%小牛血清hat選擇培養(yǎng)液重懸。將上述細(xì)胞，加到已有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔板內(nèi)，每孔加100μl。一般一個(gè)免疫脾臟可接種4塊96孔板。將培養(yǎng)板置37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。