1970年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了mrna的5’端結(jié)構(gòu)——帽子結(jié)構(gòu)（m7gpppn），它一方面保護(hù)mrna使其具有穩(wěn)定性，另外一方面，5′端帽子還是前體mrna剪接、多聚腺苷酸化及和核輸出的標(biāo)識(shí)符。同時(shí)，mrna的5′端帽子結(jié)構(gòu)如果出現(xiàn)異常，將會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生抗病毒反應(yīng)。因此，rna加帽和mrna的擴(kuò)增，促進(jìn)了mrna的大規(guī)模生產(chǎn)，mrna疫苗成為可能。
一、mrna加帽原理
真核生物mrna加帽需要在tpase、gtase、n7 mtase等酶的參與下合成帽子結(jié)構(gòu)，原理如下：
（1）rna三磷酸酶（tpase）從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸，生成 5’-二磷酸 rna
pppn1(p)n.-oh(3')→ ppni(pn)x-oh(3')+pi
（2）rna 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（gtase）通過賴氨酸-gmp 共價(jià)中間體將 gmp 基團(tuán)從 gtp 轉(zhuǎn)移到 5’-二磷酸
ppn1(pn)x-oh(3')+gtp→g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3')+ppi
（3）嘌呤-n7 甲基轉(zhuǎn)移酶（鳥嘌ling-n7 mtase）在鳥嘌ling帽的n7胺上添加一個(gè)甲基，形成基本帽結(jié)構(gòu)（cap0）
g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3')+adomet → m7g(5')ppp(5')n1(pn)x-oh(3')+ adohyc
（4）m7g 特異性 2’o-甲基轉(zhuǎn)移酶（mrna cap 2′-o-methyltransferase）還可將核糖2’o位置的核糖核苷酸甲基化生成cap1結(jié)構(gòu)
m7gpppn1(pn)x-oh(3')+adomet → m7gppp[m3'-o]n1(pn)x-oh(3')+ adohyc
cap 0 rna cap 1 rna
二、rna加帽酶的應(yīng)用
1. 促進(jìn)靶蛋白的表達(dá)
mrna是蛋白質(zhì)合成的模板，因此，將mrna導(dǎo)入細(xì)胞，促進(jìn)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。
2. 促進(jìn)cap0/cap1的rna合成
根據(jù)上述mrna的加帽原理，合成cap0/cap1結(jié)構(gòu)的mrna。
3. 合成mrna疫苗
只要獲取致病因子的序列，在rna加帽酶和rna自擴(kuò)增技術(shù)下，合成mrna疫苗。對(duì)比于減毒疫苗，mrna疫苗不會(huì)對(duì)載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；對(duì)比于dna疫苗，mrna疫苗無需轉(zhuǎn)錄直接翻譯成蛋白質(zhì)，反應(yīng)時(shí)間更快、作用更有效。三、加帽方法
1. 酶法加帽
利用上述的加帽原理，即可獲得cap0/cap1結(jié)構(gòu)。北京百奧創(chuàng)新科技有限公司提供的cellscript加帽試劑盒（貨號(hào)：c-sccs1710）的反應(yīng)時(shí)間短，加帽效率高（接近100%），同類產(chǎn)品可直接交叉使用。
2. 共轉(zhuǎn)錄法加帽
轉(zhuǎn)錄起始，加入帽類似物，轉(zhuǎn)錄本沿著帽類似物延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)錄完成形成的mrna就具有帽子結(jié)構(gòu)。