1. 新鮮組織立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片( 也可- 80℃保存)，厚度為 5～6μm。
2. 載玻片可不打底，裱片后，立即用電吹風(fēng)吹干。
3. 如不馬上染色，可密封后- 20℃保存。
4. 染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分鐘。
5.pbs洗 2 次，每次 5 分鐘，( 必要時(shí)應(yīng)用 0.1%檸檬酸鈉+0.1%triton打孔)
6. 3% h2o2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，20 分鐘，避光;
7. 用 pbs 洗 2 次，每次 5 分鐘;
8. 正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周?chē)乃?(保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài),)滴加正常山羊或兔血清 (與第二抗 體 同源動(dòng)物血清)處理，37℃，15 分鐘。
附：正常血清配制 ( 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制)：按 1:20比例，用 pbs 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計(jì)算。
9.滴加*抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加*抗體，37℃ 2 小時(shí)(也可置于 4℃冰箱過(guò)夜) 。
10.pbs：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。
11.滴加*化的二抗，37℃，40 分鐘。
12.pbs：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。
13.滴加三抗 (sab 復(fù)合物) ，37℃，40 分鐘。
14.pbs：5 分鐘，2 次(置于搖床) 。
15.dab 顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止(自來(lái)水沖終止) 。
附：dab 的配制① 儲(chǔ)備液(dab 25mg/ml)的配制：dab 250mg + pbs 10ml，待*溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μl 等，-20℃，凍存。② 工作液：dab 儲(chǔ)備液 20μl + pbs 1000μl + 3% h2o2 5μl
16.自來(lái)水(細(xì)水)充分沖洗。
17.蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來(lái)水沖洗。
18.自來(lái)水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。
19.梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 ，2 次，5 分鐘。
20.二甲苯透明：i ，ii (二甲苯)各 5 分鐘
21.封片：加拿大樹(shù)膠(或中性樹(shù)膠)封片。
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