一、基本原理
細(xì)胞凋亡檢測(cè)早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識(shí)別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰*（ps）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使ps暴露在細(xì)胞膜外表面。ps是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使ps暴露在細(xì)胞膜外。annexin v是一種ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，annexin v具有易于結(jié)合到磷脂類如ps的特性。對(duì)ps有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的ps。ps轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用annexin v結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性的檢測(cè)方法。
二、試劑與儀器
1、孵育緩沖液：10mmol/l hepes/naoh，ph 7.4，140mmol/l nacl，5mmol/l cacl2
2、標(biāo)記液：將fitc- annexin v（寶靈曼公司產(chǎn)品）和pi加入到孵育緩沖液中，終濃度均為1ug/ml
3、流式細(xì)胞儀
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為（1~5）×106，/ml 500~1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。
2、用孵育緩沖液洗滌1次，500~1000r/min離心5min。
3、用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10~15min。
4、500~1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。
5、加入熒光（sa-flous）溶液4℃下孵育20min，避光并不時(shí)振動(dòng)。
6、流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)用488nm，用一波長(zhǎng)為515nm的通帶濾器檢測(cè)fitc熒光，另一波長(zhǎng)大于560nm的濾器檢測(cè)pi。
7、結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如pi有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的dna可被pi著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡檢測(cè)的早期pi不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正常活細(xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（fitc-/pi-）；右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（fitc+/pi+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（fitc+/pi-）。
hplc法含量測(cè)定 100mg 100574-200401 *
含量測(cè)定 100mg 100575-200903 *鈉
含量測(cè)定 50mg 100578-200401 異煙肼
含量測(cè)定 100mg 100580-200501 *
含量測(cè)定 100mg 100581-200501 *
uv法含量測(cè)定 50mg 100583-200401 *
hplc法含量測(cè)定 100mg 100584-200401 *
含量測(cè)定 100mg 100585- 201003 *
含量測(cè)定 100mg 100586-200401 *
檢查用 50mg 100587-200901 雙硫化物
細(xì)胞凋亡檢測(cè)