1 材料
1.1 細胞
大鼠心肌細胞株 h9c2（購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心）。
1.2 藥品與試劑
附子樣品共 4 批，購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，產(chǎn)地分別為云南（批號：hspyn）、陜西漢中（批號：hspsxhz）、四川江油（批號：hspscjy 和 hspscjy1）。新（中國食品藥品檢定研究院，批號：110799-201608）；dmem 培養(yǎng)基（美國 hyclone 公司，批號：ae）；胎牛血清（美國 gibco 公司，批號 a10112-2770）；0.25 % 胰 蛋白酶（美國hyclone 公司，批號：mhe86395）；青、*（美國 hyclone 公 司，批 號：ab，j170012）；cck-8（碧云天生物 技 術(shù)有限責(zé)任公司，批號：）；pbs（北京益美源生物科技有限責(zé)任公司，）。
1.3 儀器
mco-15a 型 co2 培養(yǎng)箱（日本三洋電機國際貿(mào)易有限公司）；yuetan 型超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；dt5-6a 型臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）；axioobserver 倒置顯微鏡（德國 zeiss 公司）；multiskan fc 型酶標(biāo)儀（美國thermo 公司）；me104e 型電子分析天平（瑞士梅特勒 - 托利多公司）；其林貝爾ql-901 型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；96 孔細胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶（美國 corning 公司）
2 方法
附子水提物由中國中藥有限公司制備，制備方法如下：分別稱取黑順片 200 g，浸泡 30 min，煎煮2 次，第 1 次加 9 倍量水，煎煮 30 min，第 2 次加 7倍量水，煎煮 25 min，200 目篩過濾，65℃減壓濃縮，測定濃縮液密度及干膏得率，冷凍干燥制備成凍干粉備用。4 個批次（批號：hspyn、hspsxhz、hspscjy、hspscjy1）的附子水提物的干膏得率分別為 21.42%、9.85%、8.79% 和 15.26%。附子水提物：精密稱取各批號附子水提物凍干粉，加入 dmem *培養(yǎng)基溶解。使用 0.22μm濾膜過濾雜質(zhì)，配制為 0.25 mg·ml-1 附子水提物母液，再用 dmem *培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。新：精密稱取新粉末，加入去離子水溶解，使用 0.22μm 濾膜過濾雜質(zhì)，配制為 18 mg·ml-1 母液。凍存于 -20℃，使用時加入 dmem *培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)工作濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。h9c2 細胞培養(yǎng)于 dmem 培養(yǎng)基（含 10 % 胎牛血清，100 u·ml-1 青、*，4 mm l- *）中，置于 37℃，5%co2 及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入 1 ml 0.25% *按照 1：3 比例傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。
3 結(jié)果
結(jié)果顯示，各密度下 h9c2 細胞在 0 ～ 48 h 為增殖期，48 ～ 60 h 到達平臺期，60 ～72 h 進入衰亡期。當(dāng)細胞密度為 2×105/ml 時，細胞生長過快，不利于下一步實驗。故選用 0.5×10/ml 或1×105/ml 密度進行下一步實驗。預(yù)實驗結(jié)果顯示附子水提物溶解濃度為250 μg·ml-1，因而選擇給藥濃度 125 μg·ml-1作為藥物測試濃度；新作為陽性對照藥，濃度選擇為 100 μg·ml-1。結(jié)果顯 示，當(dāng)細胞密度為 0.5×105/ml，作用時間為 12 h 時，附子水提物和新對細胞增殖抑制作用較強，且作用穩(wěn)定，rsd<15%。故選用 0.5×105/ml，藥物作用 12 h 進行后續(xù)實驗。
免責(zé)聲明：文章僅供學(xué)習(xí)和交流，如涉及作品版權(quán)問題需要我方刪除，請聯(lián)系我們，我們會在時間進行處理。