（□sayyes提供）
蔣建偉 何文珊 嚴(yán)玉霞 岑穎洲
摘 要 目的和方法：采用分光光度法及電泳法，以離體rbc膜，肝勻漿還原型谷胱甘肽(gsh)水平，質(zhì)粒dna損傷程度為檢測(cè)指標(biāo)測(cè)定茶多酚對(duì)離體生物組織的抗氧化作用。結(jié)果：茶多酚能顯著抑制紫外線致人rbc溶血作用(p＜0.01)；能顯著抑制60co γ射線致質(zhì)粒puc19dna單鏈斷裂作用(p＜0.05或p＜0.01)；對(duì)vitc/fe2+激發(fā)的肝勻漿gsh耗竭，茶多酚也具有顯著的抑制作用(p＜0.05或p＜0.01)。結(jié)論：茶多酚具有良好的抗氧化作用，能保護(hù)離體rbc，組織gsh，dna免受氧自由基損傷。
主題詞 茶；溶血；質(zhì)粒；谷胱甘肽
the antioxidative effect of tea polyphenols in vitro
jiang jian-wei， he wen-shan， yan yu-xia， cen yin-zhou1
dept. of biochemistry, medical college, 1 dept. of chemistry,
jinanuniversity, guangzhou (510632)
abstract aim:to assess the antioxidative effect of tea
polyphenols (tp) on free radical damage. mehtods: used hemolysis,
changes of conformation of plasmid puc19,
glutathione(gsh) levels of
mice liver homogenates as indexes. results: tp could reduce
significantly the degree of hemolysis of erythrocyte suspensions
induced by uv (p＜0.01). tp could reduce the degree of single-strain
break of plasmid puc19 induced by 60co γ-rays (p＜0.05 or p＜0.01).
tp could inhibit the exhaustion of gsh levels of mice liver
homogenate initiated by vit c/fe2+ (p＜0.05 or p＜0.01). conclusion:
tp had a good antioxidative function, it can prevent rbc membrane,
plasmid dna, tissue gsh suffering from oxygen free radical damage in
vitro.
mesh tea; hemolysis; plasmids;glutathione
近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)茶葉除了有解渴提神的功效，還有消炎抑菌，降低血壓、血糖，抗衰老，抗氧化，抗癌，抗突變等功效［1，2］。茶葉中的主要活性成分是嘌呤類生物堿及多酚類化合物。茶多酚(tea polyphenols, tp)是茶葉中分離提純的多酚類化合物復(fù)合體，約占茶干物重的25％,它有30多種酚性物質(zhì)組成,其中兒茶素類含量最多［1］。研究茶多酚清除生物自由基的作用與機(jī)理，對(duì)茶葉的藥用研究有較大的理論和應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)活性氧自由基清除作用的研究通常用電子自旋共振法(esr)進(jìn)行［3，4］，但實(shí)驗(yàn)儀器昂貴，操作也較復(fù)雜，一般實(shí)驗(yàn)室難以應(yīng)用。本文采用分光光度法及電泳法研究茶多酚對(duì)離體rbc膜，dna，肝組織勻漿的抗氧化作用，來(lái)探討茶多酚的生物學(xué)活性。
材料與方法
一、材料：
茶多酚：廣東英德茶廠生產(chǎn)，純度＞95％。dtnb［5,5－二硫雙-(2-硝基苯甲酸)］，fluka公司出品。還原型谷胱甘肽(gsh)，上海酵母廠生產(chǎn)，生化試劑。puc19購(gòu)自華美公司。昆明種小鼠，20～22 g，雄性，購(gòu)自本校動(dòng)物中心。新鮮健康人血，購(gòu)自本院第一附屬醫(yī)院血庫(kù)。
二、方法：
1.照射條件：紫外線(ultravoilet, uv)照射用30 w uv燈進(jìn)行，樣品分裝于10 ml燒杯內(nèi)，置于燈正下方10 cm處，照射25 min。質(zhì)粒puc19照射采用60co γ射線照射，樣品距源中心線60 cm，高120 cm，照射劑量率為16.67 gy/min，照射劑量為100 gy。
2.溶血試驗(yàn)：人血rbc用生理鹽水(ns)洗滌后，作1:90稀釋，分組見(jiàn)表1,每組重復(fù)6管。加樣后用30w紫外燈照射25min，然后置4℃ 24 h，離心取上清，用722分光光度計(jì)于540 nm測(cè)吸光值(a)。
3.質(zhì)粒puc19 dna斷裂試驗(yàn)：取0.67 μg/μl粒2 μl，加入一定量的茶多酚，加入te緩沖液（ph7.4），使終體積為32 μl，分組見(jiàn)表2。60co γ射線100 gy照射后，置4℃ 8h，用0.8％瓊脂糖電泳（電泳緩沖液為0.5×tbe，電泳70v 3h），后用溴乙錠（eb）染色15 min。采用凝膠圖像掃描系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，求出各孔超螺旋、開環(huán)型質(zhì)粒所占的百分率。以λ dna/hindⅲmarkers作為標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)照物，以檢測(cè)各條電泳帶的dna分子大小及構(gòu)象。
4.肝勻漿gsh耗竭與測(cè)定：小鼠脫頸椎致死，立即取出肝組織，以4℃生理鹽水作5％(w/v)組織勻漿，取2 ml肝勻漿，加入一定量的茶多酚(tp)及生理鹽水(ns)，見(jiàn)表3，每組重復(fù)7管。加入1 mmol/l vitc和50 μmol/l feso4各0.2 ml，37℃水浴孵育60 min，激發(fā)氧自由基致gsh耗竭［5］。后用2 ml 10％tca沉淀蛋白，離心取上清0.5 ml,加入0.2 mol/l磷酸緩沖液(ph8.0)2 ml及0.04％dtnb顯色劑0.3 ml，混勻5 min后用722型分光光度計(jì)412 nm處測(cè)吸光值(a)。
以1 mmol/l gsh用同法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將上述吸光值代入gsh標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求得組織gsh含量，單位以μmol/g濕重表示。
各項(xiàng)數(shù)據(jù)用平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差()表示，t檢驗(yàn)判定兩組間差異的顯著性。
結(jié)果
(一)溶血試驗(yàn)：結(jié)果見(jiàn)表1。
表1tp拮抗uv致人血rbc溶血作用
tab 1 effect of tp on hemolysis degree induced by uv
tp n absorbance
()
0 6 0.550±0.037
1.67 mg.ml-1 6 0.019±0.007*
3.33 mg.ml-1 6 0.011±0.002*
*p＜0.01, vs 0 group
實(shí)驗(yàn)得出，uv可致人血rbc溶血，茶多酚顯著抑制uv致血rbc溶血作用，與對(duì)照組相比，差異十分顯著(p＜0.01)。
(二)質(zhì)粒puc19dna單鏈斷裂測(cè)定：質(zhì)粒puc19是雙鏈環(huán)狀dna，2 686 bp。雙鏈環(huán)狀dna常呈超螺旋構(gòu)象，若dna單鏈斷裂則轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)型質(zhì)粒，若雙鏈斷裂則轉(zhuǎn)變?yōu)榫€型質(zhì)粒。60co γ射線照射可導(dǎo)致dna鏈斷裂。實(shí)驗(yàn)證明，低劑量(10～180 gy)γ射線照射，導(dǎo)致部分dna單鏈斷裂，呈超螺旋和開環(huán)型質(zhì)粒，未發(fā)現(xiàn)線型質(zhì)粒；高劑量(例400 gy)照射，則導(dǎo)致dna雙鏈斷裂，全部轉(zhuǎn)變?yōu)榫€型質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)采用100 gy γ射線照射，部分超螺旋dna由于單鏈斷裂而轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán)型，茶多酚抑制了受照開環(huán)型質(zhì)粒百分率的升高，即抑制了受照質(zhì)粒dna單鏈斷裂作用,與照射對(duì)照組相比,差異有顯著性(p＜0.05或p＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。
表2 60co γ射線致質(zhì)粒puc19 dna單鏈斷裂的測(cè)定
tab 2 test of single-strain break of plasmid puc19
induced by 60 co γ-rays ()
group n tp
(mg.ml-1) supercoil
(%) open coil
(％)
control1 2 0 69.68±2.47 30.32±2.47
control2 3 0 49.06±2.28 50.94±2.28
tp1 3 2.81 55.97±2.84* 44.03±2.84*
tp2 3 5.62 59.32±4.24* 40.68±4.24*
tp3 3 8.43 62.78±0.93** 37.12±0.93**
control1：control and not irradiated; control 2:control and irradiated
*p＜0.05, **p＜0.01, vs control 2
fig 1 test of single-strain break of plasmid puc19 induced by 60 co γ－rays
a： supercoil；b：open coil
1： λdna/hind ⅲ markers； 2， 3： control and not irradiated； 4，5，6： control and irradiated； 7，8，9： tp1； 10，11，12： tp2；13，14，15： tp3
圖1 60co γ射線致質(zhì)粒puc19 dna單鏈斷裂的測(cè)定
(三)肝勻漿還原型谷胱甘肽(gsh)耗竭與測(cè)定：對(duì)vit c/fe2+誘使的小鼠肝勻漿gsh耗竭， 茶多酚有顯著的抑制作用(p＜0.05或p＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3：
表3 tp拮抗 vit c/fe2+致使小鼠肝勻漿gsh耗竭的測(cè)定
tab 3 test of tp inbibition the exhaustion of gsh levels of mice
liver homogenate initiated by vit c/fe2+ (,n=7)
tp absorbance(a) gsh(μmol.g-1)
0 0.164±0.025 7.96±0.23
0.45mg.ml-1 0.185±0.023* 9.12±0.12*
0.90mg.ml-1 0.229±0.030** 11.60±0.51**
*p＜0.05,**p＜0.01， vs 0 group
討論
溶血試驗(yàn)是檢測(cè)生物抗氧化試驗(yàn)的常用方法之一。uv照射rbc懸液，激發(fā)水產(chǎn)生.oh，.oh是目前已知的最強(qiáng)氧化劑［6］。.oh攻擊rbc膜上多不飽和脂肪酸導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，致使膜通透性增加，血紅蛋白滲出導(dǎo)致溶血。茶多酚顯著抑制了uv導(dǎo)致的rbc溶血作用，說(shuō)明茶多酚能抑制rbc膜的.oh的氧化損傷。
用質(zhì)粒dna代替基因組dna來(lái)作為抗自由基損傷的檢測(cè)指標(biāo)有以下優(yōu)點(diǎn)：dna損傷程度檢測(cè)簡(jiǎn)單、迅速；細(xì)胞內(nèi)有較強(qiáng)的dna修復(fù)系統(tǒng)，而質(zhì)粒中沒(méi)有；細(xì)胞中有一系列抗氧化的酶(sod，cat，gsh-px)，有一些代謝中間產(chǎn)物、氧化還原體系而質(zhì)粒中沒(méi)有。采用質(zhì)粒做實(shí)驗(yàn)對(duì)象，避免了這些因素的干擾。質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀dna，呈超螺旋構(gòu)象。在質(zhì)粒提純過(guò)程中，由于機(jī)械剪切作用可能出現(xiàn)開環(huán)、線型質(zhì)粒。我們選用的質(zhì)粒puc19為超螺旋，開環(huán)兩種。60co γ射線導(dǎo)致質(zhì)粒dna輻射損傷主要是由于.oh作用引起的［7］。100 gy照射質(zhì)粒，其超螺旋型質(zhì)粒百分率明顯下降，開環(huán)型質(zhì)粒百分率明顯升高，說(shuō)明自由基導(dǎo)致了dna單鏈斷裂。而茶多酚抑制了開環(huán)型質(zhì)粒百分率的升高，(p＜0.05或p＜0.01)，說(shuō)明茶多酚抑制了.oh致質(zhì)粒dna的輻射損傷作用。
肝組織gsh水平測(cè)定亦可用作檢測(cè)抗氧化作用。gsh是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（gsh－px）作用的必需底物，它可被氧化為氧化型谷胱甘肽。gsh可用dtnb顯色法直接測(cè)定［8］。vit c/fe2+是氧自由基發(fā)生系統(tǒng)［5］，氧自由基氧化gsh導(dǎo)致gsh耗竭，茶多酚抑制了氧自由基對(duì)gsh的氧化作用，說(shuō)明茶多酚具拮抗氧自由基損傷的作用。
茶多酚是一類多酚類化合物，它具有還原性。本實(shí)驗(yàn)證明，茶多酚對(duì)離體rbc，dna或肝勻漿的氧自由基損傷具有顯著的抑制作用。
* 廣東省自然科學(xué)基金資助
作者單位：蔣建偉 嚴(yán)玉霞 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室
岑穎洲 化學(xué)系（廣州，510632）
何文珊 華南理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院
參考文獻(xiàn)
1 陳為鈞，萬(wàn)圣勤.茶多酚藥效研究概況.中草藥，1993,24(9):493.
2 于新蕊，曲軍，叢月珠.茶葉的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展.中草藥，1995,26(4):219.
3 沈生榮，趙玉芳，楊賢強(qiáng)，等.茶多酚保護(hù)生物大分子的自由基機(jī)理.浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995,21(4):361.
4 鄒曦露，萬(wàn)謙，李美芬，等.茶多酚對(duì)鼠心肌缺血再灌產(chǎn)生氧自由基的清除.波譜學(xué)雜志，1995,12(3):237.
5 許實(shí)波，趙金華，胡群，等.軟珊瑚膽甾烯抗氧化作用研究.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1997,13(1):81.
6 李培峰，李文彬.自由基與抗衰老研究.見(jiàn)：方允中，鄭榮梁，沈文梅，主編.自由基生命科學(xué)進(jìn)展.第2集.第1版.北京：原子能出版社，1994.7～11.
7 周麗君，方允中，章?lián)P培，等.質(zhì)粒pbr322的γ輻射損傷效應(yīng).輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，1993,11(1):28.
8 朱大江，褚先秋，都定元，等.充血性心力衰竭肝組織還原型谷胱甘肽與丙二醛變化及超微結(jié)構(gòu)觀察.貴州醫(yī)藥，1996,2(3):136.