實(shí)驗(yàn)方法原理 采用標(biāo)記有雌二醇單克隆抗體的膠體金顆粒與相對(duì)應(yīng)的固定在硝酸纖維膜上的雌二醇結(jié)合物相結(jié)合，固定有雌二醇結(jié)合物的檢測(cè)線處就顯現(xiàn)明顯的顏色。
實(shí)驗(yàn)材料
雌二醇抗體
試劑、試劑盒
氯金酸牛血清白蛋白卵清白蛋白兔抗鼠多抗雌二醇
儀器、耗材
硝酸纖維膜玻璃纖維膜分光光度計(jì)低溫高速離心機(jī)點(diǎn)膜機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑與儀器
氯金酸；牛血清白蛋白、卵清白蛋白、兔抗鼠多抗；雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品、雌二醇單抗、17β-estradiol-6-one6-(o-carboxymethvyoxime)。硝酸纖維膜、玻璃纖維膜；beckman du530分光光度計(jì)；低溫高速離心機(jī)；點(diǎn)膜機(jī)。
二、 方法
1. 膠體金的制備
用三蒸水溶解氯金酸，使其終濃度為01g/l,*行沸水浴，待氯金酸溶液煮沸后，每100 ml加入1%檸檬酸三鈉25ml，再沸水浴下快速攪拌，直到氯金酸溶液的顏色穩(wěn)定，繼續(xù)沸水浴10 min，冷卻至室溫后，用透射電鏡鏡檢并用分光光度計(jì)檢測(cè)顆粒均勻度及粒度。zui后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>2. zui適標(biāo)記蛋白量的確定
用0.2mol/l k2co3將膠體金溶液調(diào)至ph為8.2，然后取試管9支，分別加入10 ml膠體金溶液。將雌二醇抗體逐級(jí)稀釋后，各取等體積稀釋液順序加入上述試管中，混勻，另設(shè)一不加抗體的對(duì)照管。放置10 min，在各管中加入0.1 ml的10% nacl，混勻后靜置2 h。觀察各管中膠體金溶液變化，未加蛋白及加入量不足的溶液顏色由紅變藍(lán)，而加入蛋白量達(dá)到或超過時(shí)的溶液則保持不變。標(biāo)記蛋白量即為zui低穩(wěn)定膠體金溶液不變色的蛋白量基礎(chǔ)上再加20%。
3. 膠體金探針的標(biāo)記
將抗體用0005mol nacl溶液透析過夜，離心除去蛋白沉淀，調(diào)至05mg/ml。取膠體金100 ml，用0.2 mol/l k2co3將膠體金溶液調(diào)至ph為9.0，磁力快速攪拌下緩慢加入24 ml稀釋的雌二醇抗體，繼續(xù)攪拌10 min，加入牛血清白蛋白(bsa)，使其zui終濃度為1%，再攪拌10 min。將初步制得的膠體金探針以4 000 r/mm離心20 min；棄沉淀，上清以10 000 r/min離心60 min；棄上清，沉淀用0.1 mol/l的磷酸鹽緩沖液(pbs)(含1%牛血清白蛋白)重新懸浮；同前離心洗滌2次，將沉淀用0.1 mol/l的pbs(ph82，含1%bsa，002%nan3)懸浮，4℃保存?zhèn)溆谩?br>4. 抗原的合成
小分子物質(zhì)難以固定在硝酸纖維膜上，只有使它連上大分子物質(zhì)才能較好地固定。本實(shí)驗(yàn)采用混合酸酐法制備*抗原。雌二醇-6-肟 43 mg，加入三正丁胺5 μl，二氧六環(huán)4 ml，冰浴冷卻到10℃以下，加入5 μl。4～10℃下反應(yīng)30 min。配制卵清白蛋白(ova)溶液(ova 10 mg，3ml水，3 ml二氧六環(huán)，1mol/l氫氧化鈉03ml)。將配制好的ova溶液加入反應(yīng)液，4℃冰浴攪拌6h，反應(yīng)過程中，用氫氧化鈉維持ph值為8.反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液加入透析袋，透析2 d。將透析液調(diào)至ph4.5，冰箱4℃，放置4天，有黃色沉淀出現(xiàn)。離心收集沉淀，冷凍干燥，4℃冰箱保存。將ova溶于透析液內(nèi)作為參比，用紫外光譜法對(duì)雌二醇-6肟-ova進(jìn)行定性檢驗(yàn)。經(jīng)紫外測(cè)定證明蛋白質(zhì)已與雌二醇衍生物結(jié)合。
5. 膠體金免疫層析試紙條制備
測(cè)試條由玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、加樣紙、吸水紙4部分組成。將玻璃纖維膜裁成6mm的細(xì)條，然后放入含1% bsa、1%tween-20的pb液中浸泡30 min，37℃烘干，zui后將膠體金探針灌注已處理好的玻璃纖維膜上，真空干燥備用。在硝酸纖維膜上用點(diǎn)膜機(jī)將上述抗原和兔抗鼠igg噴成2條線，分別為檢測(cè)線和對(duì)照線，經(jīng)真空干燥后，用1% bsa、0.1mol/l pbs（ph9.0)封閉2 h，以0.1 mol/l pbs洗滌，再真空干燥。將30 mm吸水紙、25 mm硝酸纖維膜、6 mm玻璃纖維膜、15 mm加樣紙，由頂部依次粘于pvc板上，裁成細(xì)條備用。
6. 檢測(cè)與判讀樣品
含已知濃度雌二醇樣品的乙醇溶液分為3組，第1組不加雌二醇，第2組為0.2 μg/ml雌二醇，第3組為0.4 μg/ml雌二醇。將加樣紙一端插入待測(cè)液，濕潤(rùn)后取出，水平放置，約3～5 min，觀察結(jié)果。如試紙條硝酸纖維膜上僅對(duì)照線呈一條紫紅色帶為陽性；如出現(xiàn)2條紫紅色帶為陰性；如質(zhì)控線不出現(xiàn)紫紅色帶，無論檢測(cè)線是否出現(xiàn)，測(cè)試結(jié)果均無效。