pcr是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)的簡(jiǎn)稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的dna片段，可看作生物體外的特殊dna復(fù)制。通過dna基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級(jí)別。pcr驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。pcr結(jié)果總是不滿意，可參考以下建議：
1、將pcr反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。
2、當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動(dòng)”開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的pcr管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dntp的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對(duì)于有問題的pcr反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常pcr擴(kuò)增。
5、沒有擴(kuò)增產(chǎn)物：在提供mgcl2緩沖液中，以0.25mmol/l為梯度增加mgcl2濃度；無mgcl2的緩沖液以0.5 mmol/l為梯度增加mgcl2濃度。
6、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果dna模板中存在rna，則按上述提示濃度補(bǔ)加mgcl2，因?yàn)樵趐cr反應(yīng)中可能缺少游離的mg2+。
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
8、檢查模板和引物的用量。
9、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板dna的用量。
10、泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板dna的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長的引物。
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時(shí)不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的pcr儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/l mgcl2∶350mmol/l dntp或2.25mmol/l mgcl2∶500mmol/l dntp組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化mg2+的濃度是必需的。
12、基因組dna模板的質(zhì)量顯著影響pcr反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)dna的長度。dna片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組dna能擴(kuò)增片段至10kb。要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的dna。請(qǐng)查閱高分子量dna提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長片段pcr擴(kuò)增時(shí)，引物長度一般為24~34個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在60~68℃間。使用這類引物可提高pcr反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（94℃下進(jìn)行20--30秒），除非模板中富含gc，則95℃下變性30秒。這可以防止dna脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組dna片段終長度超過12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。
14、延伸：68--72℃下進(jìn)行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若pcr儀無此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷pcr系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3’-末端帶有一個(gè)突出的a，因此建議采用t/a克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用klenow酶和t4 dna多聚酶將pcr產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。測(cè)序時(shí)因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。
15、引物設(shè)計(jì)： 一般長度20-30bp； 至少50%的gc含量；避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)； 引物對(duì)的tm值應(yīng)該接近。