熒光照射條件下的顯微照相呈現(xiàn)出一組*的環(huán)境，為顯微鏡專家?guī)砹颂厥鈫栴}。曝光時(shí)間通常非常長(zhǎng)（在某些情況下從幾秒鐘到幾分鐘），樣品的熒光在曝光期間可能會(huì)褪色，而*黑色的背景通常會(huì)無意中發(fā)出光度計(jì)信號(hào)，表明過度曝光。
另外，熒光標(biāo)本發(fā)射它們自己的光，并且位于所需焦平面上方和下方的粒子經(jīng)常輻射光，導(dǎo)致圖像細(xì)節(jié)模糊。盡管通過顯微鏡目鏡觀察時(shí)熒光圖像可能看起來很亮（由于人眼對(duì)光線的敏感性），但為了在膠片上記錄令人滿意的圖像，它們通常需要較長(zhǎng)的曝光時(shí)間。非常長(zhǎng)的曝光使得用熒光染料染色的樣本的顯微照相復(fù)雜化，增加了振動(dòng)的可能性和膜互易失效效應(yīng)，導(dǎo)致圖像中不希望的色移。
雖然熒光顯微照相的基本問題通常是光線到達(dá)膠片的缺乏，但是可以采取許多步驟來改善圖像質(zhì)量。用于熒光的顯微鏡物鏡應(yīng)具有盡可能高的數(shù)值孔徑，在實(shí)驗(yàn)中使用光波長(zhǎng)的高透射率值。因?yàn)楣鈴?qiáng)度（反射光熒光）隨數(shù)值孔徑的四次方變化，所以這些物鏡可以顯著減少反射光熒光顯微鏡中的曝光時(shí)間。光強(qiáng)度也與放大倍數(shù)的平方成反比變化，當(dāng)膠片上的總放大率保持小時(shí)，導(dǎo)致更亮的圖像。通常使用低放大率光學(xué)鏡（或投影鏡頭）來輔助降低膠片平面上的放大率。此外，當(dāng)使用三目頭時(shí)，通常希望將所有光轉(zhuǎn)向攝像機(jī)，而不是在觀察目鏡和攝像機(jī)之間進(jìn)行光分離（通過分束器）。因?yàn)閳D像強(qiáng)度也與到膠片平面的距離的平方成反比地變化，所以顯微鏡表現(xiàn)得更好，然后該距離保持很短。出于這個(gè)原因，并且由于廣泛的可用性，當(dāng)使用傳統(tǒng)的顯微攝影術(shù)捕獲圖像時(shí)，大多數(shù)熒光顯微鏡記錄在35毫米膠片上（而不是更大的格式）。
低光照水平和熒光標(biāo)本的褪色是熒光顯微照相術(shù)中要克服的兩個(gè)主要困難。通常，熒光制劑的動(dòng)態(tài)性質(zhì)使得良好的顯微攝影術(shù)對(duì)于捕獲與樣本發(fā)生的事件的記錄是必要的，并且通?？梢栽谕ㄟ^目鏡檢查樣本時(shí)揭示不明顯的細(xì)節(jié)。長(zhǎng)時(shí)間曝光，如此常用于熒光，不可避免地導(dǎo)致在長(zhǎng)時(shí)間照射期間的互易失效和樣本熒光強(qiáng)度的褪色。實(shí)際上，特定熒光特征的衰落通常比背景的快，導(dǎo)致圖像對(duì)比度的損失。
所有照相乳劑（包括黑色和白色，彩色負(fù)片和彩色透明膜）在暴露于光下超過長(zhǎng)時(shí)間或短時(shí)間時(shí)都會(huì)受到稱為互易律失效的影響。互易律將圖像密度與曝光時(shí)間和光強(qiáng)度聯(lián)系起來，使得顯微鏡中的照明強(qiáng)度與膠片所需的曝光時(shí)間之間存在相互關(guān)系。實(shí)際上，該法律規(guī)定曝光時(shí)間與光強(qiáng)度成反比，以保持恒定的膠片密度。光強(qiáng)度越低，產(chǎn)生令人滿意的圖像所需的曝光時(shí)間越長(zhǎng)。如果適當(dāng)?shù)钠毓獬掷m(xù)時(shí)間在1/500秒和1/2秒之間，則這種反比關(guān)系適用于大多數(shù)膠片。
在熒光顯微鏡中，低光照水平通常需要超過1/2秒的曝光（通常在幾秒到幾分鐘的范圍內(nèi)）。在這些條件下，互易關(guān)系不再成立，并且膠片將需要額外的曝光時(shí)間以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)膱D像密度。這種現(xiàn)象稱為互易失效，該術(shù)語(yǔ)僅表示曝光時(shí)間和光強(qiáng)度之間的線性關(guān)系不再成立，并且不表示薄膜乳液在性能方面的失效。
互易律失效的副作用是通過樣品的光漂白進(jìn)一步降低已經(jīng)很弱的樣品熒光，并且由于曝光時(shí)間增加經(jīng)常發(fā)生不正確的顏色再現(xiàn)。圖2中呈現(xiàn)的一系列圖像是熒光顯微照片，其示出了當(dāng)使用olympus wib長(zhǎng)通熒光立方體成像時(shí)用流行的熒光素-5-異硫氰酸酯（fitc）標(biāo)記的抗體熒光染料。使用針對(duì)互易律失效校正的校正曝光時(shí)間和kodak wratten顏色補(bǔ)償濾光器拍攝中心的單元（圖2（b）），以消除不希望的色移。在左側(cè)（圖2（a）），相同的視野顯示了由于長(zhǎng)時(shí)間暴露于照射源而導(dǎo)致的光漂白或熒光活性的褪色的影響。
通?？梢酝ㄟ^增加曝光時(shí)間或黑白膠片的加工條件來補(bǔ)償互易失效，但對(duì)于彩色負(fù)片和透明膠片來說并非總是如此。大多數(shù)彩色膠片具有三個(gè)顏色敏感的染料層，每個(gè)顏色敏感的染料層具有略微不同的特征曲線位置和斜率，導(dǎo)致對(duì)互易效應(yīng)的變化響應(yīng)，可能引起不希望的顏色偏移或鑄造。通常，在使用彩色膠片時(shí)，必須調(diào)整曝光時(shí)間和色彩平衡濾光片以補(bǔ)償非常長(zhǎng)或短的曝光。
利用具有非常小的數(shù)值孔徑的物鏡（例如，具有na = 0.65的40x物鏡而不是具有0.85,0.95或1.0的na的相同放大物鏡）產(chǎn)生顯示亮度不足的圖像，這導(dǎo)致更長(zhǎng)的時(shí)間曝光時(shí)間。數(shù)值孔徑是物鏡聚光能力的量度，意味著高數(shù)值孔徑物鏡可以捕獲更大量的發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生的弱熒光發(fā)射。在進(jìn)行熒光顯微照相時(shí)，始終使用可用的物鏡數(shù)值孔徑。使用過多的物鏡和光電目鏡放大也會(huì)導(dǎo)致亮度降低。為了彌補(bǔ)這一點(diǎn)，在給定的放大倍數(shù)下，始終采用盡可能低的放大率光學(xué)物鏡和數(shù)值孔徑物鏡。例如，數(shù)值孔徑為0.95（亮度指數(shù)= 22.6）的60x平面復(fù)消色差物鏡優(yōu)于數(shù)值孔徑等于0.85（亮度指數(shù)= 14.5）的60x平面螢石物鏡，即使螢石物鏡的工作距離為復(fù)消色差的兩倍。此外，由于高數(shù)值孔徑物鏡具有較淺的景深，因此它們的使用可以避免從焦平面上方或下方的離焦發(fā)射的對(duì)比度降低效應(yīng)。同樣，2.5x光鏡將提供比3.3x或5x目鏡更多的照明。
物鏡亮度值物鏡放大數(shù)值孔徑（na）物鏡亮度指數(shù)
10 0.25 3.9
10 0.30 8.1
10 0.45 41.0
10 0.50 62.5
20 0.40 6.4
20 0.50 15.6
20 0.75 79.1
40 0.65 11.1
40 0.75 19.8
40 0.95 50.9
40 1.00 62.5
40 1.30 178.5
60 0.85 14.5
60 0.95 22.6
60 1.40 106.7
100 1.25 24.4
100 1.40 38.4
表格1
細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域的典型熒光應(yīng)用不僅涉及樣本亮度，還涉及特定樣本熒光與內(nèi)在背景熒光的比率。這對(duì)于單分子熒光事件和其他低光實(shí)驗(yàn)尤為重要，其中物鏡內(nèi)部的自發(fā)熒光和/或內(nèi)部反射在低熒光量子產(chǎn)率的小結(jié)構(gòu)成像能力方面產(chǎn)生巨大差異。為了在熒光顯微鏡設(shè)計(jì)的物鏡中大化信噪比（背景上的樣品熒光強(qiáng)度），制造商使用石英和其他特殊玻璃配方，在從紅外到紫外的整個(gè)光譜范圍內(nèi)具有高透射率。這些物鏡在自發(fā)熒光方面極低，并利用特殊的光學(xué)水泥和抗反射涂層，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)展的熒光激發(fā)波長(zhǎng)范圍。與*玻璃配方相結(jié)合的更高數(shù)值孔徑提供了現(xiàn)代熒光物鏡，能夠以低至340納米的波長(zhǎng)激發(fā)樣品，具有更高的透射率，以獲得更亮的熒光圖像。
表1列出了常用放大倍率和數(shù)值孔徑的標(biāo)稱物鏡亮度值的比較。這些數(shù)字是根據(jù)下式計(jì)算的：
亮度指數(shù)=（na）4 /（放大率）2 ×透射比
其中na是物鏡數(shù)值孔徑和傳動(dòng)比假定為100,000。從該等式可以看出，對(duì)于相同的放大率，照明場(chǎng)和二次熒光的圖像亮度隨著物鏡的數(shù)值孔徑而增加，但是隨著放大率的增加而減小。特定物鏡的實(shí)際數(shù)值孔徑和放大率值可以與標(biāo)稱值相差多達(dá)5-10％。如上所述，由物鏡透射的亮度還取決于內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)，例如玻璃透鏡元件的數(shù)量，內(nèi)部反射和眩光，以及透鏡涂層。經(jīng)常，
使用盡可能高的數(shù)值孔徑聚光器和透射光熒光，以避免光線損失和伴隨的長(zhǎng)曝光時(shí)間。此外，在較舊的顯微鏡上使用子鏡時(shí)，購(gòu)買一個(gè)帶有鍍鋁表面而不是鍍銀鏡的鏡子（銀會(huì)很難反射紫外線）。通常，油浸暗場(chǎng)聚光鏡可以代替用于透射熒光應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)明場(chǎng)聚光鏡。使用浸油時(shí)，在聚光鏡的頂部透鏡和顯微鏡載玻片的下側(cè)之間以及物鏡前透鏡和蓋玻片之間涂抹非熒光油。這種油很容易從許多商業(yè)制造商處獲得。
光漂白或染料光解會(huì)迅速降解用于染色樣品的熒光探針，并應(yīng)盡可能將制劑暴露在盡可能低的光照水平下。這種效應(yīng)主要是由熒光染料和氧氣之間的光動(dòng)力學(xué)相互作用引起的，其涉及通過稱為系統(tǒng)間交叉的過程將染料分子從單重基態(tài)促進(jìn)到相對(duì)長(zhǎng)壽命的三重態(tài)激發(fā)態(tài)。。一旦發(fā)色團(tuán)升高到激發(fā)態(tài)，它就變得更具化學(xué)反應(yīng)性，然后可以參與不可逆的化學(xué)反應(yīng)，包括分解，聚合，氧化（主要通過單線態(tài)氧）或與另一個(gè)分子反應(yīng)。與氧反應(yīng)通常會(huì)引起發(fā)色團(tuán)的漂白，這取決于細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧濃度和發(fā)色團(tuán)與其他內(nèi)部細(xì)胞組分如蛋白質(zhì)，脂質(zhì)或小分子的接近程度。計(jì)算表明單線態(tài)氧可以在超過500埃的距離上產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)光解。
為了大限度地減少光漂白的影響，熒光顯微鏡可以與其他對(duì)熒光染料無破壞性的技術(shù)相結(jié)合，如差分干涉對(duì)比度（dic），霍夫曼調(diào)制對(duì)比度（hmc），透射暗場(chǎng)照明和相位對(duì)比度。我們的想法是使用非破壞性對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)在樣本中定位感興趣的特定區(qū)域，然后在不重新定位樣本的情況下，將顯微鏡切換到熒光模式。這種類型的典型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖3和4中。圖3（a）示出了使用相差光學(xué)器件成像的單層組織培養(yǎng)物中的3t3成纖維細(xì)胞。該細(xì)胞系由國(guó)立衛(wèi)生研究院的瑞士小鼠胚胎細(xì)胞系建立，它們具有高度接觸抑制作用，可用于涉及肉瘤病毒形成和白血病病毒繁殖的研究。圖3（b）中的顯微照片顯示了相同的視野，但這次使用熒光照明（水銀蒸汽燈和olympus wu濾光片立方體）成像，細(xì)胞被熒光染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色（dapi） ），核酸特異性染料，發(fā)射大值為461納米，用于選擇性染色細(xì)胞核和染色質(zhì)。圖3（c）說明組合使用的兩種技術(shù)，以產(chǎn)生疊加在成纖維細(xì)胞膜和內(nèi)部細(xì)胞器的相差圖像上的熒光染色的3t3細(xì)胞核的美麗顯微照片。
另一個(gè)組合技術(shù)的例子，這次使用差分干涉對(duì)比度（dic），如圖4所示。圖4（a）所示是貓腦組織的薄切片感染隱球菌并使用dic光學(xué)和全波成像延遲板。注意顯微照片的偽三維外觀。圖4（b）顯示了相同的視野，但是用熒光照明和olympus wib濾光片立方體成像。圖4（b）中的細(xì)胞用熒光素-5-異硫氰酸酯（fitc）和剛果紅（發(fā)射波長(zhǎng)大值分別為520和614納米）的組合染色。這兩種技術(shù)組合使用以產(chǎn)生圖4（c），其示出了熒光和dic照射中感染的貓腦組織。
光漂白的速率取決于若干因素，包括發(fā)色團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)性，細(xì)胞內(nèi)化學(xué)環(huán)境以及激發(fā)光的強(qiáng)度和波長(zhǎng)。一些熒光染料容易受光漂白影響，而其他熒光染料相對(duì)不敏感并且在更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定。在許多情況下，樣品可以從光漂白的效果中恢復(fù)，特別是如果它保持涼爽并且在黑暗環(huán)境中。應(yīng)將光漂白與另一種稱為猝滅的熒光偽影區(qū)分開來這是通過在鹽或鹵素化合物存在下通過諸如溫度，高氧濃度和分子聚集等競(jìng)爭(zhēng)過程減少（或在某些情況下，增強(qiáng)）熒光強(qiáng)度而發(fā)生的。有時(shí)猝滅是由于能量轉(zhuǎn)移到物理上靠近激發(fā)的熒光染料的其他受體分子，這種現(xiàn)象稱為共振能量轉(zhuǎn)移。這種特殊現(xiàn)象已成為測(cè)量遠(yuǎn)低于光學(xué)顯微鏡橫向分辨率的距離的新技術(shù)的基礎(chǔ)。發(fā)色團(tuán)中的雜質(zhì)還可以通過光漂白或猝滅來降低熒光強(qiáng)度。
通過減少曝光時(shí)間（如上所述）或通過降低激發(fā)能量（燈強(qiáng)度）可以使光漂白小化，然而這些補(bǔ)救措施伴隨著降低發(fā)色團(tuán)熒光發(fā)射能量的不良效果。中性密度濾光片可以在光到達(dá)激發(fā)濾光器之前放置在光路中，從而減小激發(fā)光強(qiáng)度并減少樣品觀察期間的褪色效應(yīng)。許多熒光顯微鏡配備了一個(gè)與中性密度濾光片相連的快門系統(tǒng)，可以在觀察和樣品操作過程中降低激發(fā)光的強(qiáng)度，但是使顯微鏡能夠輕松切換到全功率照明以進(jìn)行顯微攝影。在可能的情況下，它也很有用正丙基丙酮酸鹽和其他抑制劑，可商購(gòu)獲得。能夠淬滅單線態(tài)氧的化學(xué)物質(zhì)也可用于降低光漂白的影響。實(shí)例是2-巰基乙胺，1,4-二氮雜雙環(huán)-2,2,2-辛烷（dabco），二苯基異苯并呋喃，對(duì)苯二胺和氨基酸*。在某些情況下，通過改變封固介質(zhì)的ph濃度，也可以減少褪色效應(yīng)。
圖5（a）說明了幾種市售抗褪色試劑對(duì)熒光褪色速率的抑制作用。藍(lán)色曲線顯示未經(jīng)處理的樣品的熒光強(qiáng)度快速下降，而綠色和紅色曲線顯示兩種效率略有不同的抗褪色試劑降低了褪色速率。標(biāo)本是用熒光素-5-異硫氰酸酯（fitc）或羅丹明鬼筆環(huán)肽染色的有袋腎組織培養(yǎng)細(xì)胞（ptk2）（兩種染料都具有相似的褪色特性）?？雇噬噭┦菍?duì)苯二胺（綠色曲線）或n沒食子酸丙酯（紅色曲線）。樣品二次熒光褪色率通常根據(jù)使用的熒光染料而不同，即使在相同條件下觀察也是如此。通過選擇具有與特定應(yīng)用可用的褪色速度低的褪色速度的熒光染料，可以獲得結(jié)果。該概念如圖5（b）所示，其比較了三種熒光染料的有袋腎細(xì)胞褪色速度的差異：羅丹明（黃色曲線），花青染料cy3（紅色曲線）和fitc（綠色曲線）。羅丹明是一種普遍存在的染料，具有多種應(yīng)用，在這些條件下顯示出非常慢的褪色速率（圖5（b）;黃色曲線），并且是使用該系統(tǒng)進(jìn)行顯微攝影的熒光染料。
為了進(jìn)一步減少褪色，建議在樣品內(nèi)的一個(gè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行初步觀察，然后在曝光前快速移至“新鮮”區(qū)域。這種做法可能有助于規(guī)避漂白和/或褪色效果。在部分黑暗的室內(nèi)環(huán)境中進(jìn)行觀察和顯微照相也是有幫助的。雖然化學(xué)方法和仔細(xì)的顯微鏡檢查可以減少光漂白，但效的方法是使用專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)的低光照級(jí)ccd數(shù)碼相機(jī)，提高檢測(cè)靈敏度（加上激發(fā)能量降低）。
光漂白的發(fā)生導(dǎo)致了一種稱為frap的技術(shù)，frap是光漂白后熒光恢復(fù)的首字母縮寫。該技術(shù)基于短激光爆發(fā)的漂白和隨后觀察由熒光染料擴(kuò)散到漂白區(qū)域引起的熒光恢復(fù)。
屏障濾光片設(shè)計(jì)用于吸收從樣品反射或透射的特定波長(zhǎng)的激發(fā)輻射，并僅透射所選擇的可見光熒光。屏障濾光片的截止波長(zhǎng)范圍是至關(guān)重要的，因?yàn)樵谠S多情況下，它必須能夠透射與用于照射樣品的激發(fā)光相差不大的可見波長(zhǎng)。由于薄膜對(duì)380-450納米區(qū)域的紫外和可見波長(zhǎng)非常敏感，因此屏障濾光器阻擋該范圍內(nèi)的所有不需要的波長(zhǎng)尤為重要。為確保去除較短波長(zhǎng)，應(yīng)在光路中添加額外的紫外線阻擋濾光片，如柯達(dá)wratten濾光片編號(hào)2a，2b或2e。所有這些濾光片都*吸收紫外線，但它們對(duì)低波長(zhǎng)可見藍(lán)光的吸收有輕微差別。應(yīng)在光路中的主屏障濾光片之前放置輔助紫外線濾光片，以阻擋可能在主屏障濾光片中引起自發(fā)熒光的輻射，特別是如果此濾光片為黃色，橙色或紅色。如果屏障濾光片在太長(zhǎng)的波長(zhǎng)處切割光譜，則樣品熒光顏色將受到影響并且圖像的強(qiáng)度可能受損，尤其是當(dāng)僅通過濾光器通過透射熒光的長(zhǎng)波長(zhǎng)部分時(shí)。應(yīng)在光路中的主屏障濾光片之前放置輔助紫外線濾光片，以阻擋可能在主屏障濾光片中引起自發(fā)熒光的輻射，特別是如果此濾光片為黃色，橙色或紅色。如果屏障濾光片在太長(zhǎng)的波長(zhǎng)處切割光譜，則樣品熒光顏色將受到影響并且圖像的強(qiáng)度可能受損，尤其是當(dāng)僅通過濾光器通過透射熒光的長(zhǎng)波長(zhǎng)部分時(shí)。應(yīng)在光路中的主屏障濾光片之前放置輔助紫外線濾光片，以阻擋可能在主屏障濾光片中引起自發(fā)熒光的輻射，特別是如果此濾光片為黃色，橙色或紅色。如果屏障濾光片在太長(zhǎng)的波長(zhǎng)處切割光譜，則樣品熒光顏色將受到影響并且圖像的強(qiáng)度可能受損，尤其是當(dāng)僅通過濾光器通過透射熒光的長(zhǎng)波長(zhǎng)部分時(shí)。
熒光顯微照相中的色彩平衡誤差可能有許多起源。圖6中顯示的顯微照片說明了在熒光照射下成像樣品時(shí)由自發(fā)熒光和不適當(dāng)過濾引起的顏色降解所引起的幾個(gè)問題。標(biāo)本是在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)的單層成纖維細(xì)胞，并用7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸（amca）染色，amca是一種明亮的紫外線可激發(fā)染料共軛物，發(fā)射波長(zhǎng)大值為445納米（簡(jiǎn)稱 - 波長(zhǎng)藍(lán)色區(qū)域）。amca的激發(fā)波長(zhǎng)為345納米，這需要通過大量紫外光的激發(fā)濾光器。在適當(dāng)?shù)恼彰骱瓦^濾條件下，如圖6（b）所示，染色的樣本出現(xiàn)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成分染成豐富的深藍(lán)色（用olympus wu濾光片立方體成像）。當(dāng)使用穿過太多紫外光的屏障過濾器時(shí)，在樣品的顯微照片中經(jīng)常出現(xiàn)藍(lán)色和背景顏色（如圖6（a）所示），并且二次熒光顏色降低。在顯微鏡光學(xué)路徑中的某處放置輔助紫外和/或短藍(lán)色波長(zhǎng)屏障濾光器是用于緩解該問題的選擇方法。和二次熒光顏色降低。在顯微鏡光學(xué)路徑中的某處放置輔助紫外和/或短藍(lán)色波長(zhǎng)屏障濾光器是用于緩解該問題的選擇方法。和二次熒光顏色降低。在顯微鏡光學(xué)路徑中的某處放置輔助紫外和/或短藍(lán)色波長(zhǎng)屏障濾光器是用于緩解該問題的選擇方法。
用于染色樣本的熒光染料經(jīng)常產(chǎn)生不希望量的短波長(zhǎng)藍(lán)色自發(fā)熒光，特別是在染色組織切片時(shí)。如上所述，這種自發(fā)熒光必須被屏障過濾器吸收，以避免由熒光染料標(biāo)記的標(biāo)本產(chǎn)生的二次熒光發(fā)射的降解?？逻_(dá)wratten濾光片2a和2e吸收短波長(zhǎng)藍(lán)光輻射，適用于此應(yīng)用。顯微鏡制造商和售后市場(chǎng)供應(yīng)商也提供有助于微調(diào)屏障過濾器截止范圍的過濾器。
安裝介質(zhì)中的內(nèi)在自發(fā)熒光也可能導(dǎo)致與圖6（a）所示的顯微照片相關(guān)的問題類型。許多流行的性固定介質(zhì)制劑表現(xiàn)出自發(fā)熒光作為不希望的副作用，不應(yīng)用于定量熒光工作。相反，應(yīng)使用純甘油，甘油 - 水混合物或無熒光浸油制成的臨時(shí)支架來制備樣品。顯微鏡制造商提供專門的物鏡，通過光學(xué)校正甘油中的樣品觀察。通過安裝介質(zhì)產(chǎn)生的自發(fā)熒光通常是淡藍(lán)色或綠色，并且將導(dǎo)致樣品的二次熒光降解。如果屏障過濾器不能去除安裝介質(zhì)產(chǎn)生的多余自發(fā)熒光，有時(shí)可以在路徑中添加柯達(dá)wratten顏色補(bǔ)償濾光片以緩解此問題。大多數(shù)介質(zhì)產(chǎn)生的淡藍(lán)色可以通過使用cc20y（黃色）等濾光片去除，淺綠色熒光可以用cc20m（品紅色）濾光片中和。使用更高密度的濾光片（cc30及以上）通常會(huì)導(dǎo)致二次熒光的吸收。
細(xì)胞和組織在培養(yǎng)物中表現(xiàn)出的自發(fā)熒光通常會(huì)限制在染色和固定制劑中檢測(cè)熒光探針的能力。固定組織顯示的自發(fā)熒光的程度通常根據(jù)樣品制備和用于檢測(cè)熒光的實(shí)驗(yàn)條件而變化。黃素輔酶（fad和fmn）和還原的吡啶核苷酸（nadh）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中自發(fā)熒光的主要來源。熒光染料染色的植物細(xì)胞中的二次熒光經(jīng)常被來自木質(zhì)素（綠色自發(fā)熒光）和卟啉（例如葉綠素）（紅色自發(fā)熒光）的自發(fā)熒光掩蓋。在染色之前，通過用磷酸鈉緩沖鹽水中的0.1％溶液*洗滌30分鐘，有時(shí)可以用固定的細(xì)胞和組織克服該問題。
當(dāng)激發(fā)和/或發(fā)射濾光片與用于染色樣品的發(fā)色團(tuán)的波長(zhǎng)吸收和發(fā)射光譜不匹配時(shí)，二次熒光通常會(huì)受到損害，如圖6（c）所示。在該示例中，使用具有太短波長(zhǎng)截止的不適當(dāng)發(fā)射濾波器來傳遞由樣本發(fā)射的二次熒光。因?yàn)檫@種熒光的大部分集中在光譜的藍(lán)色區(qū)域（455納米），所以濾光器僅通過泥紅色的長(zhǎng)波長(zhǎng)色調(diào)。要糾正問題，應(yīng)選擇新的屏障過濾器。彩色膠片的過度曝光以及互易誤差也會(huì)導(dǎo)致終圖像中二次熒光的顯著色移。
當(dāng)顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)配置錯(cuò)誤或使用錯(cuò)誤的濾光器組合時(shí)，熒光顯微鏡中經(jīng)常出現(xiàn)對(duì)比度誤差。圖7中顯示了這些誤差中的一些，其說明了由不適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)濾光器選擇和熒光浸漬油引起的二次熒光圖像中的對(duì)比度差。標(biāo)本是日本楓葉葉柄的橫截面，其經(jīng)歷自發(fā)熒光并使用olympus wbv過濾器立方體用10x螢石物鏡成像。在理想條件下，將獲得圖7（b）中呈現(xiàn)的圖像。然而，當(dāng)激發(fā)濾光器具有太大的帶寬（允許不需要的波長(zhǎng)通過）時(shí)，圖像會(huì)失去對(duì)比度，從而產(chǎn)生圖7（a）所示的顯微照片。選擇正確的濾光片組合需要知道用于染色樣品的發(fā)色團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射的光譜值。在這種情況下，激發(fā)濾光片通過高達(dá)550納米的波長(zhǎng)，干擾樣品發(fā)出的綠色二次熒光，嚴(yán)重影響圖像對(duì)比度。
在熒光顯微鏡中控制樣品對(duì)比度要求顯微鏡的所有光學(xué)組件都沒有自發(fā)熒光，并且它們不應(yīng)該在很大程度上散射光。這包括內(nèi)部玻璃透鏡元件，鏡子，濾光器和分束器。物鏡應(yīng)提供高圖像質(zhì)量，同時(shí)將高效率的光傳輸?shù)浇贤夥秶?。濾光片必須傳輸所需的波長(zhǎng)，同時(shí)阻擋可能干擾二次熒光觀察的其他波長(zhǎng)。因?yàn)榧ぐl(fā)光的強(qiáng)度比樣本熒光強(qiáng)得多，從熒光圖像中*去除這種光的任務(wù)不是很容易，并且需要仔細(xì)選擇提供窄范圍激發(fā)波長(zhǎng)（通常在10到75納米帶寬內(nèi)）的濾光器組合。當(dāng)使用高數(shù)值孔徑浸沒物鏡時(shí)，浸油必須沒有可能表現(xiàn)出熒光的污染物。圖7（c）示出了浸沒油中自發(fā)熒光產(chǎn)生的不良對(duì)比度的實(shí)例。雖然浸油的使用有助于提高圖像亮度，部分是通過消除表面反射（特別是蓋玻片和玻璃鏡片元件）引起的錯(cuò)誤光線的損失，誘發(fā)自發(fā)熒光的熒光污染物將不需要的波長(zhǎng)與來自樣品。
樣本制備中的偽像也會(huì)在熒光顯微鏡中產(chǎn)生對(duì)比度問題。熒光的早期經(jīng)常使用非特異性熒光染料，由于染料分子隨機(jī)散布在整個(gè)樣品中，因此產(chǎn)生非常明亮的圖像。具有改進(jìn)的和高度特異性的熒光染料的較新的熒光技術(shù)已經(jīng)導(dǎo)致樣品顯示出染色的靶區(qū)域具有基本上較弱的熒光，因?yàn)檎澈系娜玖仙俚枚?。這些較新的方法需要更仔細(xì)的樣品制備，以避免不必要的熒光偽影。用非熒光染料對(duì)部分樣品進(jìn)行預(yù)染色通常是有幫助的，這些染料競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)以幫助熒光染料選擇性。在將樣品放置在用非熒光玻璃制成的酸洗顯微鏡載玻片上之前，應(yīng)*清洗樣品以去除未結(jié)合的熒光染料。通過添加化學(xué)添加劑以小化光漂白來優(yōu)化熒光染料環(huán)境有助于減少或消除樣品褪色。此外，仔細(xì)選擇封固劑的化學(xué)成分和ph值對(duì)于從二次熒光中獲得圖像非常重要。如上所述，蓋玻片和浸油也應(yīng)該是非熒光的。仔細(xì)選擇封固劑的化學(xué)成分和ph值對(duì)于從二次熒光中獲得圖像非常重要。如上所述，蓋玻片和浸油也應(yīng)該是非熒光的。仔細(xì)選擇封固劑的化學(xué)成分和ph值對(duì)于從二次熒光中獲得圖像非常重要。如上所述，蓋玻片和浸油也應(yīng)該是非熒光的。
由于樣品的固有性質(zhì)或染色錯(cuò)誤，可能發(fā)生自發(fā)熒光和/或非特異性熒光。這種類型的典型錯(cuò)誤如圖8（a）所示，其顯示用熒光素-5-異硫氰酸酯（fitc）和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）的混合物染色的大鼠結(jié)腸組織的薄切片。 。顯微照片中的整體藍(lán)色投射是由于dapi熒光染料的過度染色導(dǎo)致的自發(fā)熒光和非特異性熒光的組合。用兩種染料進(jìn)行適當(dāng)染色，然后*洗滌樣品，得到圖8（b）所示的顯微照片。類似于圖8（a）所示的錯(cuò)誤也是由于使用太寬的激勵(lì)帶寬引起的，一個(gè)可逆的錯(cuò)誤，可以通過使用帶寬較窄的濾波器來糾正?；蛘?，可以采用激發(fā)濾光器的組合來選擇性地產(chǎn)生一組特定的波長(zhǎng)，或者可以調(diào)節(jié)屏障濾光器以僅通過更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。圖8（c）示出了當(dāng)正確染色時(shí)的大鼠結(jié)腸薄切片，但現(xiàn)在由于光學(xué)路徑中缺少紅色抑制濾光器而導(dǎo)致淺紅色背景。通過在光路中放置適當(dāng)?shù)囊种茷V波器可以糾正此錯(cuò)誤。圖8（c）示出了當(dāng)正確染色時(shí)的大鼠結(jié)腸薄切片，但現(xiàn)在由于光學(xué)路徑中缺少紅色抑制濾光器而導(dǎo)致淺紅色背景。通過在光路中放置適當(dāng)?shù)囊种茷V波器可以糾正此錯(cuò)誤。圖8（c）示出了當(dāng)正確染色時(shí)的大鼠結(jié)腸薄切片，但現(xiàn)在由于光學(xué)路徑中缺少紅色抑制濾光器而導(dǎo)致淺紅色背景。通過在光路中放置適當(dāng)?shù)囊种茷V波器可以糾正此錯(cuò)誤。
熒光顯微照相術(shù)也遇到其他形式的光學(xué)顯微鏡和顯微照相術(shù)遇到的常見問題。這些包括由光學(xué)元件和膠片平面之間的焦距調(diào)節(jié)不當(dāng)引起的聚焦誤差，顯微鏡支架振動(dòng)，污垢和碎片污染，曝光不足，曝光過度，色彩平衡錯(cuò)誤，鏡面反射（長(zhǎng)時(shí)間曝光和頭頂房間照明常見），漸暈和光學(xué)顯微鏡未對(duì)準(zhǔn)。這些錯(cuò)誤的實(shí)例在olympus顯微鏡資源中心顯微鏡入門的顯微照相部分的標(biāo)題為熒光顯微照片錯(cuò)誤和顏色透明薄膜的部分中給出。
用于熒光顯微照相的相機(jī)和膠片 - 膠片技術(shù)的改進(jìn)提高了膠片速度和分辨率，但目前還沒有適用于熒光顯微照相的彩色膠片。各個(gè)彩色薄膜的特定性質(zhì)，包括各個(gè)乳劑層的特性曲線，耦合染料的性質(zhì)，以及用于熒光激發(fā)和發(fā)射的光的光譜響應(yīng)通常在不同薄膜之間變化很大，并且有時(shí)難以控制和再現(xiàn)。這些問題導(dǎo)致難以使用膠片保持準(zhǔn)確的顯色和曝光以及彩色顯微照相。
熒光顯微照片中的曝光測(cè)量由于熒光樣品內(nèi)的亮度范圍通常遠(yuǎn)大于可準(zhǔn)確記錄在膠片上的事實(shí)而變得復(fù)雜。高光的過度曝光將導(dǎo)致精細(xì)細(xì)節(jié)和色彩飽和度的損失，而曝光不足會(huì)產(chǎn)生非常暗的圖像，這些圖像不會(huì)顯示隱藏在陰影區(qū)域中的特征。背景通常非常暗或黑，對(duì)于過度曝光或曝光不足都不是至關(guān)重要的。使用熒光時(shí)，使用三種主要方法來確定曝光：使用ccd，光電二極管或光電倍增管進(jìn)行亮度測(cè)量，曝光期間的連續(xù)測(cè)量（光電倍增管），以及不理想的方法，試驗(yàn)和誤差。設(shè)計(jì)用于熒光的現(xiàn)代顯微攝影系統(tǒng)具有測(cè)量照明強(qiáng)度并基于該讀數(shù)計(jì)算曝光時(shí)間的能力。對(duì)于常規(guī)熒光顯微照相，一些相機(jī)具有用于確定曝光持續(xù)時(shí)間的硅藍(lán)檢測(cè)器單元，而其他相機(jī)具有用于測(cè)量極微弱樣本的光電倍增管計(jì)量檢測(cè)器。
涂膜性能iso編號(hào)光敏感度解析度晶粒尺寸暴露容忍度
25-50 低 高 精細(xì) 寬
100-200 介質(zhì) 介質(zhì) 介質(zhì) 介質(zhì)
400+ 高 低 粗 低
表2
在選擇用于熒光顯微照相的檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)考慮幾個(gè)因素是很重要的。這些包括探測(cè)器的噪聲水平和圖像的信噪比，空間和時(shí)間分辨率，幾何失真，線性和光譜靈敏度。在確定熒光標(biāo)本的適當(dāng)曝光時(shí)，使用具有ccd或光電倍增管計(jì)量系統(tǒng)的攝像機(jī)，以便進(jìn)行精確的低光測(cè)量。點(diǎn)測(cè)量能力對(duì)于測(cè)量實(shí)際發(fā)熒光的區(qū)域是有價(jià)值的，而不是對(duì)發(fā)熒光材料周圍的通常深色背景的不希望的計(jì)量。另一種技術(shù)涉及使用曝光調(diào)節(jié)控制來減少曝光時(shí)間，否則通過測(cè)量視場(chǎng)的暗背景會(huì)過度延長(zhǎng)曝光時(shí)間。在這方面，奧林巴斯和尼康提供的相機(jī)系統(tǒng)具有內(nèi)置算法，可在相機(jī)設(shè)置為熒光模式時(shí)減少曝光。當(dāng)光線不足時(shí)（通常大部分時(shí)間都是熒光），設(shè)置三目棱鏡將所有光線發(fā)送到膠片平面，以減少曝光時(shí)間。
理想情況下，應(yīng)該在顯微照相系統(tǒng)中包括一個(gè)點(diǎn)測(cè)量?jī)x，以幫助確定在暗背景下只能看到幾個(gè)明亮物體時(shí)的曝光。對(duì)于在沒有點(diǎn)測(cè)光計(jì)的情況下在整個(gè)視場(chǎng)上進(jìn)行的集成光測(cè)量，曝光時(shí)間應(yīng)減少一半或四分之一的計(jì)量讀數(shù)（對(duì)于深色背景上的散射熒光物體），非常類似于暗視野顯微鏡的情況。如果點(diǎn)測(cè)光傳感器位于視場(chǎng)中間的固定位置，則必須首先將樣本移動(dòng)到場(chǎng)的中心以獲得適合曝光測(cè)量的區(qū)域，然后重新定位以構(gòu)成顯微照片。相機(jī)系統(tǒng)允許平板儀表傳感器的平移，以使顯微鏡技師能夠在曝光測(cè)量之前確定顯微照片組成。在定位用于顯微照相的樣本之后，然后可以將點(diǎn)測(cè)量?jī)x傳感器移動(dòng)到視野中亮的區(qū)域以進(jìn)行曝光測(cè)量而不會(huì)干擾樣本。使用點(diǎn)測(cè)光表時(shí)，確保熒光物體足夠大以填充光斑并記錄準(zhǔn)確的曝光讀數(shù)。
一些顯微攝影相機(jī)系統(tǒng)提供分束器組件，其將一部分光引導(dǎo)至光度計(jì)，其允許在實(shí)際曝光期間進(jìn)行光測(cè)量以補(bǔ)償褪色。這是一種方便的方法，用于在運(yùn)行中調(diào)整曝光時(shí)間以避免光漂白偽影，但它具有降低指向膠片的光強(qiáng)度的缺點(diǎn)，需要更長(zhǎng)時(shí)間的曝光。更*的計(jì)算機(jī)輔助攝像系統(tǒng)能夠通過方便存儲(chǔ)在計(jì)量系統(tǒng)存儲(chǔ)器中的預(yù)編程查找表來補(bǔ)償互易性故障和衰落。通過相機(jī)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)的互易故障的自動(dòng)校正通過將以下等式應(yīng)用于曝光計(jì)算來操作：
t c =（t m）p
其中tc是校正曝光時(shí)間，tm是計(jì)量（未校正）時(shí)間，p是根據(jù)系統(tǒng)查找表中容納的各個(gè)薄膜的互易值確定的常數(shù)。該系統(tǒng)受到在計(jì)量系統(tǒng)的初始編程期間添加到查找表的膠片的互易數(shù)據(jù)的數(shù)量和類型的限制。
如果沒有完整的曝光測(cè)光系統(tǒng)，必須通過跟蹤和誤差確定曝光時(shí)間。該方法涉及在各種曝光時(shí)間下進(jìn)行一系列試驗(yàn)曝光，逐步增加一半到一個(gè)完整的光圈（包圍）。處理完膠片后，會(huì)仔細(xì)記錄產(chǎn)生效果的曝光，并為使用相同顯微鏡配置的進(jìn)一步顯微照相提供基礎(chǔ)。樣品照明或顯微鏡設(shè)置的改變將需要另一系列曝光支架來確定新的曝光時(shí)間。如果僅改變物鏡放大率，則可以從先前記錄的括號(hào)數(shù)據(jù)計(jì)算新的曝光時(shí)間。許多進(jìn)行熒光顯微鏡檢查的顯微攝影師將其曝光時(shí)間上下三次或更多次，確保他們能夠確保在其中一個(gè)設(shè)置下獲得正確的曝光。保持良好的曝光記錄和相關(guān)設(shè)備數(shù)據(jù)可以減少或消除對(duì)未來包圍的需求。當(dāng)使用試錯(cuò)法確定曝光時(shí)，明智的做法是連續(xù)監(jiān)視顯微鏡燈輸出，以確定燈老化時(shí)發(fā)生的照明偏差。使用這種曝光測(cè)定方法的顯微鏡專家通常依靠slr相機(jī)來捕獲具有熒光照明的圖像。使用這些相機(jī)，在曝光期間快門和取景器鏡的移動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致振動(dòng)，從而導(dǎo)致圖像不清晰。在進(jìn)行曝光之前，通?？梢酝ㄟ^使用遙控快門開關(guān)和/或升高鏡子來避免這個(gè)問題。在某些相機(jī)中，自拍的操作會(huì)釋放鏡子.
專門用于熒光照明的顯微鏡通常在系統(tǒng)或聚焦望遠(yuǎn)鏡中具有發(fā)光的掩模版，這允許顯微鏡師可視化疊加在非常暗的背景上的微弱可見標(biāo)本上的顯微攝影光柵。奧林巴斯和尼康都在其顯微鏡中提供標(biāo)線，提供可選擇的十字線和膠片框架顏色，以便觀察樣品。顯微鏡師可以選擇紅色或黃色照明的光罩。紅色掩模版具有保持觀察者眼睛的暗適應(yīng)性的優(yōu)點(diǎn)，并且當(dāng)在藍(lán)色和綠色二次熒光上觀察時(shí)提供優(yōu)異的對(duì)比度。對(duì)于紅色熒光，當(dāng)使用同時(shí)相位對(duì)比或dic時(shí)，應(yīng)選擇黃色標(biāo)線以大化對(duì)比度。
選擇用于熒光顯微照相的膠片時(shí)，膠片速度（asa或iso等級(jí)）是一個(gè)應(yīng)該仔細(xì)考慮的變量。iso等級(jí)越高，其他條件相同，在膠片上注冊(cè)滿意圖像所需的光量就越少。熒光顯微鏡中使用的照明光源需要日光平衡的薄膜乳液，以準(zhǔn)確地呈現(xiàn)樣品的二次熒光顏色。大多數(shù)主要電影制造商提供各種iso透明度和彩色負(fù)片格式的日光膠片。標(biāo)準(zhǔn)為200或400或kodachrome 200的柯達(dá)日光ektachrome，均為35毫米，均為正透明膠片，具有足夠的速度，良好的色彩再現(xiàn)和可接受的分辨率。fujichrome provia提供400和1600 iso等級(jí)，并且在色彩飽和度和分辨率方面是一款出色的透明膠片。其他制造商生產(chǎn)相當(dāng)?shù)耐该髂z片，但我們建議盡可能避免使用彩色底片。
對(duì)于黑白膠片，柯達(dá)提供t-max 400，這是一種優(yōu)質(zhì)的中等粒度膠片，是熒光應(yīng)用的之一。有幾種黑白膠片可以使用標(biāo)準(zhǔn)顏色負(fù)面化學(xué)品（c41）加工。其中包括kodak t-max 400cn，kodak advantix和ilford xp-2 super，所有這些都提供iso等級(jí)400.請(qǐng)記住，更快的膠片可以縮短曝光時(shí)間，但會(huì)增加粒度。表2列出了基本的薄膜特性供參考。
對(duì)比度是熒光顯微照相術(shù)中的問題之一，它不僅取決于顯微鏡的配置，還取決于所選薄膜的物理特性，顯影過程，曝光細(xì)節(jié)和樣品本身與熒光染料染色效率的關(guān)系。和光漂白或褪色。彩色透明膠片可以通過一個(gè)或多個(gè)f-stop曝光不足（考慮互惠和褪色時(shí)的獎(jiǎng)勵(lì)），然后按通過延長(zhǎng)顯影劑中的處理時(shí)間來處理，以增加對(duì)比度和顏色飽和度。許多黑白膠片會(huì)產(chǎn)生對(duì)比度的變化，這取決于顯影劑的混合條件和處理時(shí)間。熒光顯微照相中膠片的分辨率主要由顯微鏡的光學(xué)參數(shù)（主要是物鏡數(shù)值孔徑）和配置的程度決定，但也在某種程度上取決于膠片特性和顯影方法。然而，在實(shí)踐中，當(dāng)顯微鏡沒有達(dá)到性能或者iso速度太高而谷物成為一個(gè)因素時(shí)，膠片分辨率才成為一個(gè)因素。
數(shù)字成像技術(shù)的進(jìn)展已經(jīng)*改變了使用電荷耦合器件（ccd）的顯微照片的捕獲。當(dāng)對(duì)多重染色的熒光標(biāo)本進(jìn)行成像時(shí)，數(shù)碼相機(jī)提供了出色的解決方案，并迅速成為許多顯微攝影師的媒介。三芯片集成彩色ccd相機(jī)的價(jià)格已降至可承受的范圍，當(dāng)與幀抓取器或數(shù)字視頻卡和計(jì)算機(jī)相連時(shí)，提供了一種收集，數(shù)字化，編輯和存儲(chǔ)熒光圖像的出色方法。
許多樣品顯示的弱熒光需要ccd檢測(cè)器規(guī)格的高性能。目前，的選擇是背面變薄的框架或行間轉(zhuǎn)移裝置，其配備有散熱器和/或用于冷卻的外部?jī)?chǔ)存器。這些相機(jī)中的許多具有接近或超過90％的量子效率并且允許在讀出之前順序獲取若干圖像。圖像采集周期從1秒到5秒不等，具體取決于讀出速率，視頻捕獲參數(shù)和ccd分辨率。符合這些規(guī)格的典型ccd相機(jī)是optronics magnafire數(shù)碼成像相機(jī)系統(tǒng)專為科學(xué)應(yīng)用而設(shè)計(jì)。這款相機(jī)采用sony icx085al 2/3英寸行間傳輸ccd，陣列尺寸為1300×1030，像素尺寸為6.7微米。60 db動(dòng)態(tài)范圍和信噪比，24位，32位或48位色的文件位深度，每像素4個(gè)電子的暗電流，16,000電子阱深度，以及相機(jī)性能得到增強(qiáng)密封氣體peltier ccd冷卻。通過多個(gè)二向色光學(xué)玻璃濾色器形成彩色圖像。optronics和其他制造商還提供各種數(shù)碼相機(jī)（圖9中所示的典型ccd相機(jī)），幾乎適用于熒光和常規(guī)光學(xué)顯微鏡的所有需求。
以下幾點(diǎn)總結(jié)了熒光顯微照相的重要方面。
使用高數(shù)值孔徑物鏡，配備對(duì)近紫外光透明的玻璃或石英鏡頭。也可以使用低放大率的投影鏡頭來限制總放大率。
反射光熒光優(yōu)于透射光熒光。如果無法將顯微鏡配置為反射光，請(qǐng)使用透射光暗視場(chǎng)聚光鏡。
通過仔細(xì)選擇膠片參數(shù)，適當(dāng)?shù)娘@微鏡配置，并通過仔細(xì)匹配發(fā)色團(tuán)激發(fā)和二次熒光特性與適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和屏障過濾器來優(yōu)化樣品對(duì)比度。
從光路中移除三目分束棱鏡，使100％的光在曝光期間到達(dá)膠片平面。也使用35毫米膠片，避免更大的膠片格式。
選擇日光平衡透明膠片，以獲得的樣品顏色，分辨率和對(duì)比度。推動(dòng)工藝透明膠片以增強(qiáng)對(duì)比度和色彩飽和度。
光源必須在非常窄的光譜范圍內(nèi)提供高強(qiáng)度輻射，通常在10到50納米之間。選擇是氙氣和汞蒸汽燈或調(diào)諧到特定波長(zhǎng)的激光。
顯微鏡光學(xué)系列，包括透鏡，鏡子，濾光片，分光鏡，浸沒介質(zhì)，顯微鏡載玻片和蓋玻片，應(yīng)該沒有自動(dòng)熒光組件。
在不查看或拍攝熒光樣本時(shí)，使用照明器中的濾光片滑塊或快門阻擋激發(fā)光，以避免光漂白導(dǎo)致樣品損壞。
始終在照明器和熒光濾光片之間提供一個(gè)熱過濾器，過熱可能會(huì)損壞熱過濾器。
監(jiān)視燈泡是否有閃爍跡象，并在照明強(qiáng)度變得不均勻時(shí)更換。保持燈泡和垂直照明器的調(diào)節(jié)，以確保適當(dāng)?shù)膋öhler照明。
仔細(xì)準(zhǔn)備標(biāo)本，并在染色后*清洗去除多余的發(fā)色團(tuán)。
總之，熒光顯微鏡領(lǐng)域正在許多醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室中迅速擴(kuò)大。熒光顯微鏡的主流已經(jīng)經(jīng)歷了從利用透射光到入射光的幾乎*轉(zhuǎn)變，伴隨著許多新的和不同的熒光染料的引入。這是推動(dòng)許多新的和變化的熒光顯微鏡應(yīng)用的推動(dòng)力。